以RNase R鉴定或富集circRNA

Ribonuclease R (RNase R)是一种3’-5’方向的RNA外切酶，主要应用于circRNA的鉴定和富集，今天湖人再和大家分享一下具体使用及常见问题。

1 RNase R反应体系

相关文章方法描述里RNase R的使用量和反应体系颇有不同，从1U-4U RNase R/μg RNA不等，下图是一个推荐的反应体系。

图1 RNase R消化反应体系（吉赛生物）

2 circRNA的鉴定

circRNA的鉴定或验证常使用RT-PCR和Northern blot实验，根据RNase R(+)和RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是circRNA。

RT-PCR中若要证明检测的基因是circRNA，需要体现在RNase R(+)和RNase R(-)组中条带有无或丰度高低有差异，也可以和分别使用Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA和gDNA样品的结果结合起来。

图2 使用RT-PCR检测mRNA，在RNase R(-)中有条带，在RNase R(+)中无条带；检测Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）

图3 RNase R消化后分别以Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA样品。RNase R(+)中Divergent Primer有条带，Convergent Primer无条带；RNase R(-)中Divergent Primer和Convergent Primer都有条带，表明检测的基因为circRNA，并且耐受RNase R消化（Yibing Y et al., 2018）

Northern blot实验使用探针特异性检测内源的circRNA和线性RNA，过程中无PCR扩增，能够真实地反映circRNA和线性RNA的定性定量分析结果，是circRNA鉴定中必不可少的一个实验。

图4 以3U RNase R/µg RNA 进行RNase R消化15分钟，电泳显示RNase R(+)组中28S/18S条带变淡。使用同时检测circRNA和mRNA的探针进行Northern blot实验，结果显示RNase R(+)组检测不到线性的Gapdh、Phf21a、Elf2、Mfsd6、Stau2或Zfp609，可以检测到对应的circRNA，表明mRNA被消化，而circRNA耐受消化（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）

图5 RNase R消化产物电泳显示RNase R(+)组中28S/18S/5S条带变淡。Northern blot检测显示RNase R(+)组中无线性GAPDH的条带，CDR1as和hsa-circRNA 2/3/16能检测到条带，表明线性RNA被消化，而circRNA耐受消化（Memczak S et al., 2013）

3 circRNA的富集

高通量测序时常需要使用RNase R对circRNA进行富集，为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。测序显示RNase R(+)组中junction reads相对于RNase R(-)样本一般有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs。

图6 RNase R(+)和RNase R(-) RNA测序示意图（Jeck WR et al., 2014）

4 RNase R消化实验结果

Total RNA经消化后直接进行电泳检测，RNase R(-)组中28S/18S/5S三条带单一明亮，而RNase R(+)组中28S/18S/5S条带会变淡或不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）。但如果RNase R+组中5S条带加亮，且28S/18S条带处有拖尾，则可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化产生的。

a b

图7 a, RNase R消化后条带变淡；b, RNase R消化后条带不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）

5 Q&As

5.1 测量浓度

实验中要先对total RNA测量浓度，以计算相应的比例和使用量来进行RNase R消化。消化后的反应液无需测量浓度，实际上因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分影响，测量到的浓度也不会准确。

5.2 纯化回收

经RNase R消化后富集的circRNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇溶液、RNA纯化柱或磁珠进行纯化回收，没条件的也可以直接使用TRIzol LS Reagent。经RNase R消化后直接进行RT-PCR的，一般可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可（Legnini I et al., 2017; Guarnerio J et al., 2016; Cheng ZF et al., 2002）。

5.3 RNase R消化反应温度和时间

RNase R消化一般于37℃进行反应，时间10-30 min为宜（Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017），不推荐过长时间的消化。另外检测不同的基因可能需要摸索反应时间，湖人实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果，线性基因丰度可以降低几十到几百倍，circRNA丰度则基本不变。

5.4 qPCR定量计算

RNase R消化后不能再使用ACTB或GAPDH作为内参，此时可以将原始的RNA等分为两份，一份进行RNase R处理（RNase R(+)），另一份不处理（RNase R(-)），统一以RNase R(-)组中的内参为计算标准（Zhang Y et al., 2016; Panda AC et al., 2018）。

另外在RNase R消化后如果进行纯化回收，RNA的浓度可能会有变化，不适宜再以RNase R(-)组中的内参为计算标准。此时可以在纯化回收前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后进行计算（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Pamudurti NR et al., 2017）。

5.5 circRNA也被消化？

实验中有时会发现经RNase R消化后部分circRNA丰度也有明显降低，此时要检查消化反应体系有无问题，考虑是否被外源RNA酶降解。另外有些circRNA经长时间RNase R消化后丰度也会降低，可能是因为其耐受RNase R消化力弱（Zhang Y et al., 2016）。

图8 RNase R消化0-120 min，Northern blot检测显示circCAMSAP1在15 min时就明显被消化（Zhang Y et al., 2016）

图9 RNase R消化后进行qPCR检测，RNase R组中has-circRNA 2/3/6/9/16和CDR1as丰度有轻微降低，但和GAPDH相比，circRNAs显示有超过10倍的耐受RNase R消化力（Memczak S et al., 2013）

湖人实验室也经常会检测到RNase R消化后circRNA丰度会降低的情况，一般缩短消化时间可以减少circRNA被消化的可能，另外对比线性RNA和circRNA消化后丰度降低的倍数，是明显能看到circRNA比线性RNA耐受消化的。

5.6 线性RNA消化不完全？

实验中经常发现经RNase R消化后做RT-PCR依然能检测到线性RNA的条带，总要怀疑是消化不够彻底或消化体系不合适。但其实这种情况是正常的，因为在限定RNase R用量和反应时间的条件下，底物中线性RNA很难被彻底消化，而增加RNase R用量或反应时间又可能导致部分circRNA被消化，因此在固定体系中平衡反应时间是很有必要的。另外注意以半定量PCR的思路，统一PCR扩增条件和循环次数，电泳检测也可能得到理想的结果图。如果RNase R消化后circRNA丰度不变或轻微降低（RT-PCR检测条带基本不变），而线性RNA丰度明显降低（RT-PCR检测条带变淡或不可见），这样的结果也是符合预期的。

图10 RNase R消化后进行PCR检测，与RNase R(-)组相比，RNase R(+)组中linear mRNA条带变淡，表明被消化；RNase R(+)组中ci-ankrd52和circCAMSAP1条带变亮，表明被富集（Zhang Y et al., 2016）

参考文献：

1. Cheng ZF, Deutscher MP. J. Purification and characterization of the Escherichia coli exoribonuclease RNase R. Comparison with RNase II. Biol. Chem. 2002; 277:21624–21629.
2. Rybak-Wolf, A. et al.. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Mol. Cell. 58, 870–885 (2015).
3. Yibing Yang et al.. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl Cancer Inst. 2018 Mar 1;110(3).
4. Suzuki H et al.. Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing. Nucleic Acids Res. 2006; 34(8), e63.
5. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al.. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013;495(7441):333–338.
6. Jeck WR, Sharpless NE. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol. 2014; 32:453–61.
7. Guarnerio J, Bezzi M, Jeong JC, Paffenholz SV, Berry K, Naldini MM et al.. Oncogenic Role of Fusion-circRNAs Derived from Cancer-Associated Chromosomal Translocations. Cell. 2016 Aug 11;166(4):1055-1056.
8. Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, Morlando M, Briganti F, Sthandier O, Fatica A, Santini T, Andronache A, Wade M, et al.. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol Cell. 2017;66(1):22–37.e29.
9. Zhang, Y., Yang, L., and Chen, L.L. (2016c). Characterization of Circular RNAs. Methods Mol. Biol. 1402, 215–227.
10. Panda AC, Gorospe M. Detection and Analysis of Circular RNAs by RT-PCR. Bio Protoc. 2018 Mar 20;8(6). pii: e2775.
11. Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L et al.. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017 Apr 6;66(1):9-21.e7.