刚入门circRNA研究的小伙伴们，平时可能会碰到一个很重要的小问题。就是文献中重点研究的circRNA的完整序列到底是什么？CircRNA接头序列怎么找？因为相当一部分文章在正文或补充材料里不会直接给出circRNA的全长序列，或对应的数据库ID。当然随着circRNA研究的推进，这种状况会慢慢改善。但如何准确快速获得感兴趣circRNA全长序列，任然是初学着应该首先掌握的技能。
本文以最近发表的一篇circRNA文献为例，跟大家一起交流如何不通过写代码快速获得circRNA全长序列。
该文研究者发现的一种全新的circRNA，起源于SCD基因的3UTR区，命名为SCD-circRNA2。实验结果表明SCD-circRNA2在肝癌组织中显著上调，是肝癌预后独立预测因子。进一步研究发现RNA结合蛋白RBM3在肝癌中高表达，与肝癌预后不良相关，RBM3高表达促进了SCD-circRNA2的表达，是SCD-circRNA2的上游调控因子。
注：
硬脂酰辅酶A 去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase， SCD) 是合成单不饱和脂肪酸的限速酶，是调节肝脏脂肪生成和脂类氧化的关键控制点。该酶活性的改变会导致脂质代谢异常，从而引起各类脂肪代谢相关疾病的产生。
下面我们一起根据文献给出的数据通过3步来寻找SCD-circRNA2的全长序列。
收集文献中circRNA序列相关信息
首先我们罗列出文章中SCD-circRNA2相关信息。
- Fig1c给出了SCD-circRNA1和SCD-circRNA2在SCD基因上起源定位示意图。Part of Exon6说明SCD-circRNA2来源6号外显子部分序列。
- Fig6a给出SCD-circRNA2序列侧翼序列相对位置，
- 补充材料Supplementary Table 2材给出了SCD-circRNA2的PCR，siRNA和northblot探针序列。
- 补充材料table5给出circRNA高通量测序SCD-circRNA2的转录起始终止染色体坐标
chr10：102122370-102122756
2．通过在线数据库UCSC genome browser检索circRNA序列
对于全新circRNA，一般类似circbase等数据库不会收录，所以检索不到。这里我们可以根据上面circRNA测序提供的SCD-circRNA2染色体坐标在UCSC genome browser(http://genome.ucsc.edu/)网站上进行分析。
- 进入UCSC基因组浏览器后，鼠标悬停Genomes处，点击进入Human GRCh37/hg19界面（此处选的是hg19基因组版本，不知道基因组版本的情况下，可能还要试试hg38版本）。
- 将circRNA染色体坐标chr10:102122370-102122756粘贴进搜索框，鼠标点击go按钮。页面会刷新进入如下界面，可以看到浏览器已经跳转到SCD基因区。
- 查看SCD基因的详细信息并确认。
- 查看SCD基因全长结构，下图可知道SCD基因由6个外显子组成。
- 根据上图点击“Get DNA for SCD”
注：UCSC坐标系统以0开始的
由于Ensembl 数据库用 1起始的坐标系统，而UCSC 用0起始的坐标系统，因此这里需要将SCD-circRNA2的起始坐标加上1，即SCD-circRNA2坐标为chr10:102122371-102122756
- 获得SCD-circRNA2的全长序列，并转换得到接头序列，转换方式见下图。
3．验证获得序列的正确性
- 利用文献中给出的PCR引物和siRNA序列，考察是否可以对应到已获取序列中。
- 利用UCSC genome browser的blat工具验证获取SCD-circRNA2序列准确性。
点击submit提交后，跳转到下面界面。
点击第一条记录的browser，跳转到下面图形界面。
上图SCD-circRNA2和SCD的定位图是不是跟文献的Fig1c一致了。
参考文献：
- Dong W, Dai Z, Liu F, et al. The RNA-Binding Protein RBM3 Promotes Cell Proliferation in Hepatocellular Carcinoma by Regulating Circular RNA SCD-circRNA 2 Production[J]. Available at SSRN 3346501, 2019.
- Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006.
- Kent WJ. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 2002 Apr;12(4):656-64.
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