肿瘤恶病质是一组症状和体征，包括营养不良、厌食、虚弱、组织消耗和器官功能障碍等，常见于晚期转移的肿瘤，恶病质可在50%的肿瘤患者中出现，占恶性肿瘤患者死因的20%-40%，是肿瘤患者死亡的主要原因之一，然而，介导癌症诱发的肌肉消瘦的恶病质关键分子机制仍然不甚明确。最近发表于《Nature Communication》的最新研究成果显示肿瘤细胞通过细胞外囊泡（EVs）释放高水平的Hsp70和Hsp90分子，从而直接激活肌肉代谢，引起恶病质产生，阻断肿瘤细胞释放Hsp70和Hsp90相关EVs有望成为癌症恶病质的有效治疗策略。该研究思路清晰并提供了大量的体内外实验证据，是肿瘤微囊泡研究方面很好的范例，下面我们一起来了解下这篇文章的研究成果。
期刊： Nature communications
影响因子：12.124
作者单位：美国德克萨斯大学
研究概要
- 发现肿瘤恶病质诱导肿瘤细胞可持续释放Hsp70和Hsp90蛋白的现象；
- 发现胞外囊泡EVs是肿瘤细胞释放Hsp70和Hsp90蛋白的载体；
- 体内外实验证明肿瘤细胞释放EVs携带高表达的Hsp70/90是导致肌肉消瘦的关键步骤；
- 证明EVs （Hsp70和Hsp90）可通过TLR4诱导肌肉消瘦并引起系统性炎症反应；
研究结果
一、肿瘤恶病质诱导肿瘤细胞可持续释放Hsp70和Hsp90蛋白
首先，研究者筛选并分析了LCM（lewis肺癌细胞条件培养液）中的分解代谢成分，发现主要的分解代谢活动都集中在分子质量约为70-100kDa的片段。质谱分析揭示这些活性片段是高纯度的Hsp70、Hsp90α和Hsp90β。然后检测了不同恶病质诱导肿瘤细胞中的Hsp70和Hsp90水平，证实持续释放高水平Hsp70和Hsp90是恶病质诱导细胞的一个共同特征。体内实验也表明恶病质小鼠模型中血清Hsp70和Hsp90升高。
持续释放高水平Hsp70和Hsp90是恶病质诱导细胞的一个共同特征，高水平的Hsp70和Hsp90可以促进肌萎缩过程。
二、高水平的Hsp70和Hsp90与EVs相关
HSP分子没有信号肽序列，无法通过从内质网到高尔基体的传统路径介导蛋白分泌。不同细胞采用不同的非传统机制释放Hsp70和Hsp90，其中一种就是通过EVs在表面表达HSPs。研究者分离鉴定了LCM和LLC荷瘤小鼠血清中的EVs，并在EVs中检测到Hsp70和Hsp90。在Hsp70和Hsp90表达水平高的肿瘤细胞和荷瘤小鼠血清中均可检测到高水平的EVs，而采用去垢剂Brij98溶解EVs和血清后，Hsp70和Hsp90浓度成倍地显著上高。这些结果表明高水平的Hsp70和Hsp90与EVs相关。
肿瘤细胞释放的EVs （Hsp70和Hsp90）可诱导C2C12细胞肌萎缩
三、肿瘤细胞释放的EVs （Hsp70和Hsp90）对诱发肌肉消瘦是必要的和足够的。
以往的研究表明，LCM通过p38 MARPK通路来激活C/EBPβ上调atrogin1和UBR2。体外体内实验中，抗体中和Hsp70和Hsp90均可阻碍LCM诱导的p38 MARPK激活，并消除对小鼠体重和肌肉等系列指标的影响，验证了Hsp70和Hsp90在诱发肌肉消瘦中的关键作用。而使用重组Hsp70和Hsp90处理肌管后可重新诱导肌肉的分解代谢。
肿瘤细胞释放的EVs （Hsp70和Hsp90）对诱发肌肉消瘦是必要的和足够的。
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四、肿瘤细胞表达的Hsp70和Hsp90是诱发肌肉消瘦的关键。
LLC细胞中，采用siRNA敲低Hsp70和/或Hsp90，而这种缺陷型细胞的调整培养基失去了诱导肌管分解代谢的能力。稳定敲低Hsp70和Hsp90构建荷瘤小鼠后发现，小鼠血清Hsp70和Hsp90也不显示升高，同时，Hsp70和Hsp90缺陷LLC肿瘤不会诱导肌肉分解代谢和肌肉消瘦。
siRNA敲低Hsp70和/或Hsp90后诱导肌管分解代谢的能力随之缺失
五、肿瘤细胞释放的EVs （Hsp70和Hsp90）可导致肌肉消瘦。
自LCM分离获取EVs并用来处理C2C12肌管，发现LLC释放的EVs以剂量依赖的方式，通过上调UBR2和atrogin1引起分解代谢反应。通过CD9-免疫沉淀的EVs处理C2C12肌管进一步验证了CD9阳性EVs在分解反应中起作用。相反地，敲低Rab27a和Rab27b（控制EVs释放的不同步骤中的GTPase）破坏肿瘤细胞释放EVs后发现，Rab27丢失会阻止EVs、Hsp70和Hsp90的释放，而不影响肿瘤细胞中Hsp70/90和AChE的表达，导致肌管的分解反应。体内实验也证明敲低Rab27a和Rab27b阻止了血清EV和Hsp70/Hsp90的非正常升高，而小鼠也免受肌肉分解代谢和肌肉消瘦。
肿瘤细胞释放EVs携带高表达的Hsp70/90是导致肌肉消瘦的关键步骤
六、肿瘤细胞释放的EVs （Hsp70和Hsp90）可通过TLR4诱导肌肉消瘦
Hsp70和Hsp90被认为是DAMPs，通过激活免疫细胞上的TLR2和TLR4来驱动先天免疫反应。EV相关HSPs可以激活受体细胞上的HSP受体，而TLR2和TLR4也在骨骼肌肉细胞上表达，因此，研究者猜想Hsp70/90通过激活TLR2/4诱导肌肉代谢。
在C2C12肌管中敲低TLR2或TLR4发现肌管对重组Hsp70和Hsp90的分解反应需要TLR4而不是TLR2。细胞实验发现分解反应的激活确实表现为TLR4依赖。此外，体内实验证明TLR4在Hsp70和Hsp90诱导的肌肉代谢中至关重要，TLR4缺陷可以消除重组Hsp70和Hsp90诱导的小鼠肌肉消瘦。
七、肿瘤细胞释放的EVs （Hsp70和Hsp90）可引发系统炎症
在LLC荷瘤小鼠发展为恶病质的不同时间点，检测血清中的细胞因子包括TNFα、IL-6、IL-1β和EVs、Hsp70和Hsp90。TNFα在21天后发展为恶病质时升高，IL-6在14天后升高；而在EVs、Hsp70和Hsp90未升高的Rab27缺陷小鼠中，血清TNFα和IL-6也未见升高，表明血清Hsp70和Hsp90介导肿瘤宿主中炎症细胞因子的升高。至于PTHrP，之前曾有报导可能通过将白色脂肪组织转化为棕色而又打肌肉消瘦，但在本文的恶病质模型中并未发现异常释放。
小鼠血清来源的EVs（Hsp70和Hsp90）可介导炎症细胞因子的升高，引发系统炎症
结语
EVs是细胞释放的膜囊泡，可以分为三类：微泡、凋亡小体和外泌体。外泌体一般为30-150nm，是三者中最小的一类，由肿瘤细胞大量释放到调整培养基和体液中。本研究中检测到的肿瘤释放到调整培养基和血清中的EVs大小约为110nm、表达标志物CD9/TSG101/AchE，这些特征均与外泌体一致。作者为了遵循外囊泡国际协会的建议采用了“外囊泡”的说法。本研究中多次运用功能缺失性和获得性实验证实了，肿瘤细胞通过释放细胞外Hsp70和Hsp90促进肌肉消瘦，引起恶病质。此外，Hsp70和Hsp90可能通过直接作用于受体或间接地增加循环炎症因子，在不同器官上发挥着肿瘤病理效应。这不仅有助于阐述Hsp70和Hsp90在肿瘤诱导肌肉消瘦中的作用，也有助于理解肿瘤是如何影响机体全身代谢的，为癌症恶病质的有效治疗策略方面提供了理论基础。