PD-L1 /PD-1靶向治疗通过阻断PD-L1 /PD-1信号通路使肿瘤细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。在2020年1月16日，哈尔滨医科大学徐世东教授团队在Cell Death & Disease 发表了一项肺腺癌中circRNA的研究工作。报道发现circRNA-002178可能通过ceRNA机制，促进肿瘤细胞中PDL1表达；同时肿瘤细胞中circRNA-002178由外泌体递送到CD8+ T细胞中，通过促进PD1 表达实现肿瘤细胞的免疫逃避。
circRNA-002178在肺腺癌临床组织样本中显著高表达
作者通过数据GSE101684 和GSE101586Z信息，发现3个circRNA（ circRNA-002178, circRNA-104939, and circRNA-104499）在LUAD肿瘤组织中高表达，然后利用qRT-PCR检测了20对临床样本，发现只有circRNA-002178在LUAD组织样本中高表达。
图1 circRNA-002178在肺腺癌中高表达【1】
circRNA-002178在肺癌细胞系中高表达
作者扩大样本量，qRT-PCR检测85对临床癌/癌旁样本和4株细胞中 circRNA-002178的表达情况，发现在肿瘤组织和肿瘤细胞系样本中，circRNA-002178均有显著高表达。此外，作者对表达丰度最高的95D细胞进行核质分离检测，结果显示circRNA-002178主要表达在细胞质中，由此作者提出猜测circRNA-002178可能通过ceRNA机制在肺腺癌中发挥功能。
图2 circRNA-002178在肺癌细胞系中高表达
circRNA-002178通过吸附miR-34a调控肺癌细胞中PDL1表达
首先通过miRanda和 RNAhydrid预测与circRNA-002178结合的miRNA，同时在TCGA数据库检索LUAD中miRNA的表达情况。作者发现30个 miRNAs在LUAD中明显下调，其中miR-30c-3p、miR-133a-3p、 miR-34a与circRNA-002178存在结合位点。qRT-PCR检测20对临床样本中miR-30c-3p、miR-133a-3p、 miR-34a的表达情况，发现只有miR-34a在LUAD组织样本中低表达，因此作者把circRNA-002178的作用靶标锁定在miR-34a上。
通过荧光素酶报告基因实验、AGO2 RIP和RNA pull-down实验，在95D细胞中证明circRNA-002178和PDL1的3’UTR区均与miR-34a存在结合作用。利用siRNA敲低circRNA-002178后，miR-34a表达得到促进，而PDL1D的表达受到了抑制，且这一变化可以被miR-34a inhibitors回复。
图3 circRNA-002178通过miR-34a调控PDL1表达
circRNA-002178在肿瘤细胞外泌体中显著升高
检测120例LUAD病人和30例正常人血清外泌体中circRNA-002178，发现LUAD组血清外泌体中circRNA-002178显著偏高；对体外培养的肺癌细胞外泌体进行检测，也显示了相同的结果。
图4 circRNA-002178在肿瘤细胞外泌体中显著升高
circRNA-002178可能经外泌体递送到T细胞中
检测LUAD患者血液中各免疫细胞，发现在CD8+ T细胞中circRNA-002178特异性高表达。在经过肿瘤细胞分泌的外泌体孵育后，CD8+ T细胞中的circRNA-002178丰度显著升高；使用LUAD患者血清分离的外泌体对CD8+ T细胞进行孵育，细胞中circRNA-002178水平也出现相同变化趋势。
图5 肿瘤外泌体孵育后CD8+ T细胞中circRNA-002178水平显著升高
circRNA-002178通过外泌体进入CD8+ T细胞调控PD1的表达
对CD8+ T细胞中异常表达的miRNA进行预测，发现miR-28-5p与circRNA-002178有2个 binding sites。通过荧光素酶报告基因实验、AGO2 RIP和RNA pull-down实验，在CD8+ T细胞中证明circRNA-002178和PD1的3’UTR区均与miR-28-5p存在结合作用。
肿瘤来源的外泌体孵育后，CD8+ T细胞中miR-28-5p表达被抑制，而PD1的表达出现明显上调； 而改用敲低circRNA-002178后的95D细胞外泌体对CD8+ T细胞进行孵育时，这一反应消失。这一结果预示CD8+ T细胞中的PD1表达，受到外泌体携带的circRNA-002178调控。
图6 外泌体携带的circRNA-002178调控CD8+ T细胞中PD1表达
这项研究提示circRNA-002178可能在调控肿瘤细胞中PDL1表达的同时，还利用分泌外泌体向免疫细胞传递信号，通过对免疫细胞PD1的调控来实现免疫逃避。外泌体中携带的大量circRNA-002178也可能成为新的肿瘤标志物，应用到临床肿瘤筛查中。此外，PDL-1/PD-1靶向治疗现在已经应用于临床治疗中，circRNA-002178对PDL-1/PD-1通路的调控，也可能是为肿瘤靶向药物的开发提供新的方向。