肝细胞癌（HCC）在发展中国家（包括中国）特别流行，大多数病人死于HCC的转移，但是潜在的转移发生机制还不清楚。最新的肝癌转移模型证明来源于原发肝癌的循环肿瘤细胞（CTCs）会引发转移。但是原发肝癌与转移的关系也是不清楚的。即使少数CTCs溢出血管着床在某一部位，局部的免疫细胞会杀伤这些CTCs，所以有假说认为原发肝癌可能提供某些支持，促进转移灶形成。例如，原发肝癌分泌的外泌体(PTDEs)提前在转移灶创造适合转移癌生存的微环境，诱导免疫抑制、纤维化和炎症，但是PTDEs对于CTCs的作用有待探讨。
已有研究报道，活性氧ROS可以促进细胞粘附，而且CTCs中的ROS水平是升高的，高水平的ROS与增强的侵袭和转移能力相关。但是调节ROS水平与CTC粘附的关系有待进一步验证。
来自浙江大学医学院附属第二医院的梁廷波教授最近在Oncogene杂志上发表了题为“Primary tumor-derived exosomes facilitate metastasis by regulating adhesion of circulating tumor cells via SMAD3 in liver cancer”的有关外泌体促进肝癌转移的研究。研究发现，肝细胞癌（HCC）以旁分泌或者内分泌的方式促进癌细胞增殖和肺转移形成。而且HCC衍生的外泌体介导了这种现象，这些恶性外泌体可以增强细胞粘附。进一步的研究明确了活性氧（ROS）调节粘附分子。粘附的肝癌细胞释放含有SMAD3 mRNA和蛋白质的外泌体，传递给游离的HCC细胞，活化受体细胞的SMAD3-ROS信号通路，以促进其粘附能力。另外，作者发现HCC病人外周血中存在含有SMAD3丰富的外泌体，其水平与疾病分期和原发肿瘤中SMAD3的表达相关。总的来说，该研究揭示了原发HCC支持转移灶形成的可能机制，并提出了含有SMAD3的外泌体在介导原发HCC和循环HCC细胞的相互通讯中的重要作用。
1. 原发肿瘤会促进肺转移
作者在皮下预先移植Huh7肝癌细胞，再通过尾静脉回输Huh7肝癌细胞，4周后观察到肺组织存在Huh7转移灶，而无预先移植Huh7组小鼠则没有发现肺转移（A, B）。假如预先在皮下移植Huh7细胞后再切除，接着尾静脉回输Huh7细胞，这时发现这组小鼠和无预先移植Huh7组小鼠的一样则没有发现肺转移，但是其中两只小鼠的皮下瘤去除不完全，会出现原部位肿瘤复发，而且其中一只小鼠出现肺转移（黄色圆圈），但这些小鼠没有肝和脑转移（C, D，table 1），说明原发肿瘤可以促进CTCs发生肺转移。
那原发肿瘤可以促进CTCs发生肺转移的机制是什么？Evans blue染色，发现皮下预先移植Huh7肝癌细胞会导致小鼠肺部血管随时间出现通透性增强的趋势，但是无统计学差异（E, F）。相比于用新鲜培养基，用Huh7细胞上清来培养不同的肝癌细胞，会增强这些细胞的存活、增殖能力和粘附能力（G-I）。
2. 原发肿瘤分泌的外泌体可以促进癌细胞的增殖和粘附
既然肝癌细胞培养上清有促进癌细胞存活、增殖和粘附的特性，作者将培养上清中外泌体成分去除，癌细胞的存活和粘附能力有明显的下降（A, B）。从上清中分离的外泌体电镜形态鉴定和WB鉴定exosome marker 蛋白，用这些原发肿瘤来源的外泌体（PTDEs）处理Huh-7细胞，会增加细胞存活（C, D）；PTDEs也可以促进Huh-7和LM3细胞的粘附（E, F）。利用fibronectin和人脐静脉血管内皮细胞HUVECs包被的板子进一步验证了，PTDEs的确促进Huh-7粘附（G-I）。RT-PCR分析和WB鉴定了PTDEs处理后Huh-7细胞内介导细胞粘附的相关基因的mRNA表达和蛋白表达明显上调了（J, K）。
3. 原发肿瘤细胞通过外泌体传递了生物活性物质到CTCs细胞
为了明确PTDEs可以被CTCs摄取，首先利用(GFP)+ Huh-7细胞和(RFP)+ LM3细胞皮下成瘤，2周后可检测到小鼠血清中存在GFP和RFP阳性外泌体（A）。GFP+ Huh-7来源的PTDEs处理Huh-7后，可在摄取了PTDEs的Huh-7受体细胞中检测到GFP荧光（B）。PKH26标记HepG2来源的PTDEs处理HepG2后，可在摄取了PTDEs的HepG2受体细胞中检测到红色荧光（D）。尾静脉回输Huh-7细胞和GFP+ Huh-7来源的PTDEs到小鼠，WB鉴定含有转移Huh-7细胞的肺组织表达GFP条带（C）。尾静脉回输GFP+ Huh-7细胞和PKH26 标记的 Huh-7来源的PTDEs到小鼠，confocal显微成像证明血中存在带红色和绿色荧光的Huh-7细胞（E, F）。
4. PTDEs上调ROS促进癌细胞的粘附
由于ROS在介导癌细胞粘附中其重要作用，而且缺氧的肿瘤微环境也会上调ROS水平。用ROS诱导剂diamide可以增加癌细胞粘附，而ROS清道夫NAC可以明显抑制癌细胞粘附，并呈现剂量依赖性（A）。缺氧24h后，癌细胞中的ROS水平和粘附能力上调，但是恢复氧供给相应时间后，癌细胞中的ROS水平和粘附能力下调（B,C），而且ROS清道夫NAC可以明显消除缺氧诱导癌细胞增强的粘附能力（D）。在不同粘附条件下，Huh7细胞来源的PTDEs可以提高Huh7细胞的ROS水平和粘附能力，而NAC则会抵消PTDEs的促粘附效果（E-I）。
5. PTDEs通过增强癌细胞中SMAD3信号通路诱导ROS的产生
TGF-β可以提高癌细胞ROS水平，上调不同的粘附相关基因和细胞粘附能力，而SIS3抑制SMAD3信号通路会明显抑制这些促效应（A-C）。PTDEs可以上调Huh7细胞内的SMAD3和其磷酸化蛋白的水平（D）；给予受体细胞Huh7 SIS3预处理，会明显抑制TGF-β和PTDEs诱导粘附增强的现象（E），另外TGF-β和PTDEs诱导SMAD3-/- Huh7细胞粘附增强的效果也有所减弱（F）；但是PTDEs不仅可以上调Huh7细胞的，还会上调SMAD3-/- Huh7细胞的SMAD3 mRNA，提示PTDEs可能转移了SMAD3 mRNA到受体细胞（H）；放线菌酮CHX可以抑制mRNA翻译，CHX处理组的SMAD3蛋白下调，而PTDEs处理可以抵消一点CHX的效果，上调了SMAD3蛋白水平，提示PTDEs可能转移了SMAD3蛋白到受体细胞（I）。相比于正常细胞来源的PTDEs，SMAD3-/- Huh7来源的PTDEs无法上调SMAD3蛋白水平（J,K）。RT-qPCR分析和WB鉴定PTDEs存在SMAD3的mRNA和蛋白（L）。为了更好滴区分供体和受体细胞的SMAD3蛋白，已明确SMAD3的转移可能性，作者在Huh7中过表达FLAG-SMAD3后，收集含有FLAG-SMAD3的外泌体与Huh7细胞共孵育，发现受体细胞中存在外源性FLAG-SMAD3 的mRNA和蛋白（M-O）。以上结果提示，癌细胞通过分泌含有SMAD3 的mRNA和蛋白的外泌体转移到受体细胞中，活化SMAD3信号通路，上调ROS的表达。
通过临床样本分析，发现相比于正常人和有良性病变的病人，肝癌病人血清中含有更高水平的含有SMAD3的外泌体（A），而且这个水平与疾病的分期、病理严重程度成正相关，与肝癌手术后的无疾病存活期呈负相关（B-D）。另外，HCC病人血清中含有SMAD3的外泌体水平越高，原发肿瘤中SMAD3的表达越低，提示原发肿瘤可能分泌含有SMAD3的外泌体（F）。同时联合检测含有SMAD3的外泌体和α-fetoprotein两个指标，会提高人HCC的诊断准确率（G）。
参考文献
1. Fu Q, Zhang Q Lou Y, et al.. Primary tumor-derived exosomes facilitate metastasis by regulating adhesion of circulating tumor cells via SMAD3 in liver cancer. Oncogene. 2018 Jul 10. doi: 10.1038/s41388-018-0391-0.