9月10日，Cell Death & Disease杂志（IF=5.959，中科院JCR二区）在线发表一篇题为“High throughput circRNA sequencing analysis reveals novel insights into the mechanism of nitidine chloride against hepatocellular carcinoma”的研究论文。该文章的通讯作者为广西医科大学的罗殿中教授和陈罡教授。
简介
氯化两面针碱（NC）在肝细胞癌（HCC）中具有抗癌作用。然而，NC对肝细胞癌的作用机制仍然很不清楚。该研究通过对氯化二硝基（NC）处理和未处理的肝细胞癌（肝细胞癌）异种移植肿瘤组织进行高通量circRNAs测序，共鉴定297个差异表达circRNAs，并通过定量PCR验证hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049。体外实验表明，hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049可以抑制肝细胞癌的恶性生物学行为，表明它们可能在肝细胞癌的发展中起重要作用。为了阐明两个circRNAs是否在肝细胞癌中起miRNA海绵作用，作者分别使用CircInteractome和miRwalk鉴定了circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的相互作用。随后，选择857个与miRNAs相关的肝细胞癌中差异表达的基因用于加权基因共表达网络分析（WGCNA），发现绿松石模块的423个基因与肝细胞癌患者的存活时间，病理分级和TNM分期显著相关。基因功能富集分析显示，423个基因主要在DNA复制和细胞周期相关的生物过程和信号级联中起作用。然后鉴定了与肝细胞癌患者的临床结果相关的18个节点基因（SMARCD1，CBX1，HCFC1，RBM12B，RCC2，NUP205，ECT2，PRIM2，RBM28，COPS7B，PRRC2A，GPR107，ANKRD52，TUBA1B，ATXN7L3，FUS，MCM8和RACGAP1）。这些发现表明，hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049与其竞争的mRNA之间的交联可能在肝细胞癌中发挥重要作用，可能作为肝细胞癌中NC的治疗靶标。
NC在体外抑制增殖并诱导肝细胞癌细胞凋亡
为了阐明NC对肝细胞癌细胞增殖的抑制作用，作者进行了细胞计数试剂盒-8（CCK8）测定，发现NC引起SMMC7721和Huh7细胞生长时间和剂量依赖性降低。 细胞周期分析显示24小时NC处理以剂量依赖性方式诱导SMMC7721和Huh7细胞中的G2 / M期阻滞，表明NC通过G2 / M期阻滞抑制细胞生长。为了确定NC是否可以在肝细胞癌细胞中诱导细胞凋亡，作者对用不同浓度的NC处理后24和48 h的SMMC7721和Huh7细胞进行流式细胞分析，结果显示NC促进肝细胞癌细胞的晚期凋亡。
图1 NC抑制肝细胞癌的细胞活力并诱导细胞凋亡
NC在体外抑制肝细胞癌细胞的迁移
为了确定NC对肝细胞癌细胞迁移的影响，作者进行了伤口愈合实验，发现NC处理以时间和剂量依赖性方式抑制SMMC7721和Huh7细胞的迁移。
图2 NC抑制HCC细胞的迁移
基于RNA-seq分析和RT-qPCR的差异表达的circRNAs
为了研究circRNAs在NC抑制肝细胞癌细胞凋亡和迁移过程的作用，收集三对NC处理和未处理的肝细胞癌异种移植肿瘤组织用于circRNAs的RNA-seq分析。结果共鉴定了297个差异表达的circRNAs，其中188个上调，109个下调。挑选三个circRNAs（hsa_circ_0088364，hsa_circ_0090049和hsa_circ_0102434）在异种移植肿瘤细胞中进行qRT-PCR验证，发现hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049的表达变化与RNA-seq结果一致。另外，使用经NC处理或未经NC处理的细胞系SMMC7721和Huh7，证实了NC对hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049表达的剂量依赖性抑制作用，表明两个circRNAs可能是NC的靶标。
图3 NC处理的差异表达circRNAs
hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049在肝细胞癌中的生物学效应
为了研究hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049在肝细胞癌中的生物学效应，作者进行了qRT-PCR实验，发现hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049在SMMC7721和Huh7细胞中的表达高于正常肝细胞LO2，表明它们可能作为肿瘤促进circRNAs。然后，作者用慢病毒在SMMC7721和Huh7中过表达这两个circRNAs（图4c，d）进行体外实验。CCK8实验表明hsa_circ_0090049促进SMMC7721和Huh7细胞的增殖，而hsa_circ_0088364对HCC细胞的增殖没有影响。与此一致，hsa_circ_0090049可以促进HCC细胞进入G1期，而hsa_circ_0088364对细胞周期没有影响。随后，作者分别用3μmol/ L和10μmol/ L NC处理SMMC7721和Huh7细胞24 h，发现hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049的高表达抑制NC诱导的细胞凋亡。
图4 hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049对HCC细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的生物学效应
此外，作者使用伤口愈合试验来探究hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049是否影响肝细胞癌细胞迁移。结果显示，hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049促进了SMMC7721和Huh7细胞的迁移。
图5 hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049对HCC细胞迁移的生物学效应。
鉴定circRNA-miRNA和miRNA-mRNA相互作用
越来越多的研究报道，circRNA作为miRNA海绵在许多人类疾病中发挥作用，包括恶性肿瘤。在这个研究中，作者用CircInteractome预测hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049的miRNA结合位点，结果，hsa_circ_0088364包含15个miRNA结合位点，hsa_circ_0090049包含4个miRNA结合位点，其中两者都包含miR-548c-3p的结合位点。
根据| log2(foldchange)| > 0.585和调整p值< 0.05，从癌症基因组图谱（TCGA）中获得4995个差异表达基因，包括3154个上调基因和1841个下调基因。 同时，从miRWalk获得3018个经实验验证的17个miRNA（不包含miR-1273）的靶标mRNA，并与4995个差异表达基因相交。 最后，确定了肝细胞癌中857个与miRNA相关的差异表达基因。
图6 鉴定circRNA-miRNA和miRNA-mRNA相互作用
检测临床上显著的基因共表达模块
作者对HCC中857个miRNA相关的差异表达基因进行WGCNA分析，MEturquoise模块（423个基因）与肝细胞癌患者的存活时间、病理学分级和TNM分期显著相关。此外，MEturquoise中的模块成员与生存、病理分级和TNM分期的基因显著相关。因此，随后的研究集中在具有临床意义的Meturquoise模块。
图7 通过WGCNA分析鉴定与肝细胞癌（HCC）临床特征相关的模块
随后作者对MEturquoise中的423个基因进行GO注释，发现这些基因主要与“DNA复制”、“染色体区域”和“核心启动子结合”有关。KEGG分析表明这些基因与“细胞周期”、“p53信号传导途径”等肿瘤相关的信号级联有关。
图8 METurquoise中423个基因的GO功能注释和KEGG分析
circRNA-miRNA-mRNA网络的构建
选择MEturquoise中的423个基因用于circRNA-miRNA-mRNA网络构建。在整合circRNA-miRNA相互作用和miRNA-mRNA相互作用后，构建了由两个circRNA（hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049），17个miRNA和423个mRNA组成的网络。
图9 circRNA-miRNA-mRNA网络图
在MEturquoise中鉴定和验证与生存相关的枢纽基因
对于MEturquoise中的423个基因，作者确定18个hubgenes基因（SMARCD1，CBX1，HCFC1，RBM12B，RCC2，NUP205，ECT2，PRIM2，RBM28，COPS7B，PRRC2A，GPR107，ANKRD52，TUBA1B，ATXN7L3，FUS，MCM8和RACGAP1）。这18个基因与MEturquoise高度相关（MM> 0.8），并且与肝细胞癌患者的生存时间、病理分级和TNM分期显著相关。根据TCGA的数据，所有这18个基因在HCC中上调。Univariate Cox分析显示，除了PRRC2A之外，hubgenes的高表达表明肝细胞癌患者的总体存活率较差。来自Kaplan–Meier plotter的364个RNA-seq数据证实了hubgenes表达与HCC患者的存活率之间的关系。RBM12B和FUS与364例肝细胞癌患者的存活率无关，但其余15个基因的高表达表明存活率较差。此外，这些hubgenes的表达与肝细胞癌患者的无复发生存（RFS）和无进展生存（PFS）之间的关联也分别通过来自Kaplan–Meier plotter的316和370个 RNA-seq数据进行了验证。
图10 鉴定MEturquoise中的18个hubgenes
参考文献：
Xiong, D. D., Feng, Z. B., Lai, Z., et al. 2019. High throughput circRNA sequencing analysis reveals novel insights into the mechanism of nitidine chloride against hepatocellular carcinoma. Cell Death & Disease. https://doi.org/10.1038/s41419-019-1890-9