4月25日，Cell杂志发表了一篇circRNA的重磅文章，介绍发现circRNA参与细胞抗病毒免疫效应机制，该机制在系统性红斑狼疮等自身免疫疾病中发挥特殊作用。文章的通讯作者是陈玲玲教授，杨力教授和上海交通大学医学院附属仁济医院沈南教授[1]。
文中作者发现许多circRNA倾向于形成16-26bp不等的小颈环结构，该结构可结合并抑制双链RNA依赖性蛋白激酶R（double-stranded RNA-activated protein kinase，PKR），当细胞受到poly(I:C)刺激处理或病毒感染时，核酸内切酶RNase L激活并降解circRNA分子，PKR被释放并激活下游抗病毒效应机制。系统性红斑狼疮（Systematic lupus erythematosus，SLE）患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中circRNA总体降低，PKR活性紊乱，但人为过表达circRNA有助于降低SLE患者PBMC中PKR的活性，将来或许有助于SLE等自身免疫疾病的治疗[1]。下面就让我们一起学习一下作者如何一步步发现这一机制的：
poly(I:C)刺激或病毒感染可促进circRNA的降解
circRNA的降解机制一直未能得到很好的解析，作者早期也是希望能通过不同的刺激条件探索与circRNA降解有关的条件和通路，于是作者分析了不同刺激条件对circRNA丰度的影响情况。作者挑选了五种广泛表达且丰度较高的circRNA分子（见图1），分析了它们在Hela细胞中分别受不同刺激条件后的表达丰度变化情况，选择的刺激条件包括：poly(I:C)刺激（常用与模拟病毒感染刺激），HT-DNA（herring testes DNA，模拟双链DNA刺激），ISD（IFN-stimulating DNA，模拟双链DNA刺激），LPS（细菌脂多糖，模拟细菌感染），Tg（thapsigargin，模拟细菌感染），IFNγ（炎症性细胞因子），α-amanitin（RNA聚合酶II抑制剂，抑制转录）。其中poly(I:C)刺激可显著降低circRNA的丰度，其他条件均变化不明显。α-amanitin是RNA聚合酶II的抑制剂，在该实验的条件下没有显著降低几个被挑选的circRNA的丰度，但叠加处理poly(I:C)则可显著降低这些circRNA的丰度，说明poly(I:C)处理是促进circRNA的降解的。poly(I:C)处理促进circRNA降解的现象也在其他细胞中得到了验证，包括PA1, THP1和 Jurkat细胞。
图1 不同刺激条件对circRNA稳定性的影响 （图片引自[1]，排列有调整）
poly(I:C)对circRNA的影响是广泛的，不是只对少数几个circRNA分子发挥作用的，并且这一降解作用也能够通过EMCV病毒感染实现。
图2 poly(I:C)刺激对circRNA稳定性的影响是广泛的 （[1]）
RNase L是poly(I:C)刺激或病毒感染后介导circRNA降解的酶
已知病毒感染或poly(I:C)处理后能激活RNase L（一种广泛存在的RNA内切酶，二聚化后可降解RNA），为分析是否是RNase L介道了poly(I:C)处理后的circRNA降解过程，作者在Hela细胞中构建了RNase L敲除细胞系，结果表明敲除RNase L后poly(I:C)处理不能显著促进circRNA的降解，巧除细胞株中回补野生型或突变型RNase L也验证了对应的现象。作者也构建了RNase L干扰的模型，也能佐证了相关的现象。poly(I:C)处理或EMCV感染后RNase L不仅能降解circRNA，也能降解线性的mRNA，但mRNA的降解比例不高，仅有10-30%，circRNA的降解比例则高达80-90%。
图3 RNase L是poly(I:C)刺激后circRNA降解的酶 （[1]）
RNase L是poly(I:C)刺激或病毒感染后介导circRNA降解的酶
细胞中存在多种识别外源致病性双链RNA分子的受体分子，大致可分为两大类，一类是通过识别不同生化特征的外源RNA分子并激活基因转录和细胞因子的表达诱导免疫反应，这一类的dsRNA受体包括TLR3，RIG-I和MDA5。另一类分子本身就具有抵抗RNA病毒活性的受体分子，包括PKR，NF90，ADAR1-p150和OAS1，它们识别不同长度的外源RNA分子，并进一步通过抑制翻译，促进降解及引入修饰等途径实现抵抗外源RNA的效应。为探索上述现象的分子机制，作者构建了体外实验体系，分别过表达纯化已知的外源RNA受体分子和circPOLR2A及对应序列的线性RNA分子，IP后Northern Blot检测相关蛋白分子对circPOLR2A及对应序列的线性RNA的结合情况。结果表明PKR和NF90可显著的结合circPOLR2A。另一种分子circCAMSAP1也验证了这一结果。
图4 circRNA结合蛋白分析 （[1]）
已知PKR在结合33bp以上的dsRNA后可自磷酸化和激活，当长度达到79bp时活性最高。但小于33bp的（16-33bp范围）的dsRNA则抑制PKR的活性。表达纯化的PKR在体外可被33bp以上的dsRNA激活自磷酸化，但16-33bp的不能激活。circPOLR2A和circCAMSAP1不能激活PKR但对应的线性分子可以激活PKR。这些体外实验说明PKR具有选择性结合circRNA的特点，结合了circRNA后自身活性受到抑制。
图5 PKR结合circRNA分子后不能被激活 （[1]）
circRNA倾向于形成16-26bp的小颈环结构
RNA分子内部的二级结构也具有双链RNA的特点，会不会是circRNA分子内部的二级颈环结构介道了与PKR的结合并抑制了它的活性？作者通过SHAPE-MaP测序分析了34种circRNA和对应序列的线性RNA分子中二级结构的情况，其中有12种circRNA得到了对应的线性RNA结果，这些分子的分析结果表明circRNA中二级结构与对应的线性RNA有所不同。circRNA中小颈环结构更多。
图6 circRNA倾向于形成小颈环结构 （[1]）
除了上述12种circRNA分子，另外还有22种circRNA分子没有得到对应线性RNA的SHAPE-MaP结果。分析这些circRNA的结果发现其中的14种分子倾向于形成小的颈环结构。因此，在34种circRNA分子中，有26种circRNA可以形成小于33bp的小颈环结构。
图7 几种circRNA分子的二级结构分析情况 （[1]）
circRNA的小颈环结构抑制PKR活性
经过上述的体外实验，初步表明circRNA分子内部的小颈环结构可以结合PKR并抑制其自磷酸化，那么这种机制是否也在细胞内存在呢？为了验证相关的机制，作者在Hela细胞中分别过表达线性和环状的POLR2A分子，然后用poly(I:C)处理，看PKR磷酸化的状态。结果表明单独过表达circPOLR2A能明显降低poly(I:C)处理后PKR的磷酸化。但换成另一种不带分子内小颈环结构的circRNA分子，circSMARCA5则不能影响PKR的磷酸化过程。在RNase L敲除的细胞中，poly(I:C)处理诱导的PKR激活作用显著减弱。
图8 circRNA小颈环结构负调控PKR的激活 （[1]）
系统性红斑狼疮患者
系统性红斑狼疮（SLE）是常见的自身免疫疾病，表现为过度的免疫激活反应，SLE患者表现出PKR的过度激活状态。作者分析了SLE与健康对照者PKR蛋白表达和磷酸化状态，结果表明SLE患者PBMC中PKR的蛋白表达有微弱上调，但其磷酸化状态显著升高。QPCR结果表明SLE患者中具有内部小颈环结构的几种circRNA表达丰度显著降低，RNA-seq分析单核细胞，B细胞和T细胞中circRNA的丰度，结果表明在B细胞和T细胞中circRNA总体丰度下降。是否在SLE的病人中circRNA的降低是导致PKR过度激活的因素？于是作者选择了三个SLE患者，分离PBMC后瞬转过表达线性或环状的POLR2A，分析PKR的磷酸化情况，结果表明过表达circPOLR2A能够降低PBMC中的PKR磷酸化状态。单独分离SLE的T细胞做相应的过表达实验也表明SLE中过表达带内部小颈环结构的circRNA可以降低PKR的磷酸化水平。
图9 红斑狼疮患者circRNA总体减少，过表达circRNA可缓解 （[1]）
至此，本文的研究数据就介绍完了。从全文的故事来看，本文的主要贡献是发现了一种基于circRNA特有的内部小颈环结构负调控PKR活性，在其他刺激条件下，RNase L可介导circRNA的降解，进而释放PKR，PKR自磷酸化并激活下游通路。这一机制显示了circRNA通过竞争性结合PKR实现细胞免疫信号通路的调控作用，对于circRNA的功能研究和细胞免疫学通路机制的认知都具有重大意义。
参考文献
1. Chu-Xiao Liu, X.L., Fang Nan, Shan Jiang, Xiang Gao, Si-Kun Guo, Wei Xue, Yange Cui, Kaige Dong, Huihua Ding, Bo Qu, Zhaocai Zhou, Nan Shen, Li Yang and Ling-Ling Chen, Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell, 2019.