胶质母细胞瘤，也称为多形性胶质母细胞瘤（GBM），是从大脑开始的最具侵袭性的癌症。最初，胶质母细胞瘤患者的体征和症状是非特异性的，可能包括头痛，性格改变，恶心和类似于中风的症状，但是症状恶化通常很快，可能会进展到无意识状态。
大多数病例的原因尚不清楚，罕见的危险因素包括遗传性疾病，如神经纤维瘤病和Li-Fraumeni综合征，以及之前的放射治疗。胶质母细胞瘤占脑肿瘤的15％，它们可以从正常脑细胞开始，也可以从现有的低级星形细胞瘤发展而来。目前的诊断通常通过CT扫描，MRI扫描和组织活检的组合来进行。目前没有明确的方法来预防这种疾病。通常的治疗手段涉及手术，之后使用化学疗法和放射疗法。药物替莫唑胺经常作为化疗的一部分使用。高剂量类固醇可用于帮助减轻肿胀和减少症状。
尽管经过了最大限度的诊断治疗后，但是患者常见的生存期只是12至15个月，低于3％至5％的人存活超过5年。如果不进行治疗，生存期通常为三个月。这是脑膜瘤中最常见的癌症，也是脑膜瘤后第二常见的脑肿瘤。每年每10万人中就有3人患上这种疾病。它通常在64岁左右开始，在男性中比在女性中更常见。
这次分享一篇发表于Mol Cancer上的一篇题为“EIF4A3-induced circular RNA MMP9
(circMMP9) acts as a sponge of miR-124 and promotes glioblastoma multiforme cell tumorigenesis”的文章，该研究发现了真核起始因子eIF4A3诱导的circMMP9通过sponge miR-124，上调CDK4和AURKA表达水平，促进多形性胶质母细胞瘤GBM的增殖、迁移和侵袭，促进胶质母细胞瘤的肿瘤形成。
1. circRNA芯片筛选差异表达的circMMP9
通过circRNA芯片表达分析，作者筛选出正常组织和GBM组织中表达差异最明显（表达上调）的circRNA——hsa_circ_0001162(circMMP9) ；生物信息学分析、PCR分析和Sanger测序结果显示，circMMP9由MMP9的12号和13号外显子环化组成，分子大小约为328bp，而且不容易被RNase R降解，证明其属于环状RNA；RT-qPCR和FISH结果显示，GBM组织中circMMP9的表达水平明显上调；同时FISH实验证明circMMP9主要位于GBM细胞的胞浆中。
2. circMMP9对GBM细胞增殖、迁移和侵袭的影响
由于在GBM细胞系中U251细胞高表达circMMP9，而U87细胞低表达circMMP9，所以后续对这两种细胞分别进行敲低和过表达实验，验证circMMP9的功能。构建circMMP9过表达质粒和针对splice junction位点设计好siRNA后，经过RNase R处理、RT-qPCR检测表达和FISH实验验证过表达和敲低circMMP9的效果符合预期；CCK-8和克隆形成实验证明过表达circMMP9明显增强细胞的增殖能力，而敲低circMMP9表达则抑制细胞的增殖能力；过表达circMMP9的细胞形态呈现出梭状、不规则和排列紊乱的情况，而敲低circMMP9的细胞形态呈现出单个、短梭状或者圆形的情况；Transwell实验证明过表达circMMP9促进细胞的迁移和侵袭能力，而敲低circMMP9则抑制该效应。
3. circMMP9直接靶向和sponge miR-124
由于circMMP9主要表达于胞浆之中，故作者猜测其在GBM中发挥作为miRNA sponge miRNA sponge的作用。对同样的GBM组织进行miRNA芯片分析差异表达的miRNA，其中hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-124-3p和hsa-miR-129-5p表达差异最明显，接着利用生物信息学分析发现，只有miR-124含有circMMP9的结合位点；过表达circMMP9可以抑制miR-124的表达，而敲低circMMP9表达会上调miR-124的表达水平；Pull-down结果和荧光素酶报告基因实验证明，miR-124与circMMP9存在相互结合作用；FISH实验证明miR-124与circMMP9共定位于胞浆；RT-qPCR和IHC实验发现GBM组织中miR-124的表达水平明显下调，与circMMP9的表达水平成负相关。
4. circMMP9通过miR-124促进GBM细胞的增殖、迁移和侵袭
为进一步明确miR-124对于circMMP9功能的影响，作者采用rescue实验证明circMMP9/miR-124轴对GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。CCK-8、克隆形成实验和transwell实验证明过表达circMMP9促进细胞增殖marker–PCNA、Ki67蛋白和EMT相关基因snail、vimentin的表达，提高GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而miR-124则抑制该促进效应；敲低circMMP9表达会明显下调细胞PCNA、Ki67蛋白和EMT相关基因snail、vimentin的表达，抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而同时给予miR-124抑制剂可以逆转该抑制效应。
5. circMMP9 通过miR-124上调 CDK4 和AURKA的表达
接着作者探讨circMMP9/miR-124轴会影响哪些信号通路，从而调控GBM细胞的表型。结合对GBM组织的mRNA芯片分析和pubmed上已报道的miR-124靶向基因分析，挖掘到了miR-124的两个靶向基因是CDK4和 AURKA；WB和IHC实验检测发现GBM组织中CDK4和 AURKA的表达水平明显上调，而且与circMMP9的表达成正相关；同时在rescue实验中，WB结果证明circMMP9通过miR-124上调CDK4和 AURKA的表达水平。
通过circinteractome数据库，作者发现circMMP9 mRNA上游存在四个eIF4A3结合位点；RIP实验证明eIF4A3可以结合MMP9 mRNA和其上游a，b，c和d部分的序列，但不结合circMMP9（e）；体外构建5种包含eIF4A3结合位点的RNA转录本进行pull-down实验，证明越多的eIF4A3结合位点，越有利于eIF4A3 和MMP9 mRNA的结合；有趣的是，敲低eIF4A3表达明显抑制circMMP9的表达，而过表达eIF4A3表达明显促进circMMP9的表达，这提示eIF4A3可以结合MMP9 mRNA上游序列，促进12和13号外显子的环化，促进circMMP9的表达。
7. 体内实验验证circMMP9的促肿瘤效应
过表达circMMP9的U87细胞在小鼠体内成瘤能力明显增强，同时成瘤组织中CDK4和 AURKA表达水平明显升高，而敲低circMMP9表达的U251细胞在小鼠体内成瘤能力明显降低，同时成瘤组织中CDK4和 AURKA表达水平明显降低。
参考文献
- Wang R, et al. EIF4A3-induced circular RNA MMP9 (circMMP9) acts as a sponge of miR-124 and promotes glioblastoma multiforme cell tumorigenesis. Mol Cancer. 2018 Nov 23;17(1):166. doi: 10.1186/s12943-018-0911-0.