1月1日，知名杂志Theranostics（影响因子8.854）在线发表了东南大学医学院巢杰教授为通讯作者的文章，介绍发现circRNA参与二氧化硅诱导的矽肺病理机制(Zhou et al., 2018)。姚红红教授为共同作者之一。
作者通过构建二氧化硅诱导的矽肺小鼠模型筛选相关的circRNA分子，发现circHECTD1在矽肺模型中出现显著的显著下调，该circRNA分子所对应的基因HECTD1已报道参与与矽肺的发生过程，因此本文重点探索该circRNA分子的作用情况。分别分析了体外二氧化硅处理的细胞模型中circHECTD1的表达情况，circHECTD1与巨噬细胞活化通路的关系，相关分子机制的探索以及病人标本中的检测和验证。
如何找到circHECTD1的？
利用二氧化硅诱导的小鼠矽肺模型，分析特征性变化的circRNA分子，找到了120种差异明显的circRNA分子，其中73种为上调。circHECTD1便在明显下调的circRNA分子中，由于已报道HECTD1基因可能与矽肺的发生有关，因此作者将研究的重点放在circHECTD1分子上。HECTD1是一种泛素化修饰的E3连接酶，主要负责识别特定泛素化底物，实现特异性降解目标蛋白分子。
图1 小鼠矽肺模型差异表达circRNA分析 （摘自(Zhou et al., 2018)）
体外验证circHECTD1与矽肺的关系
矽肺往往伴随着肺泡巨噬细胞的活化，作者利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行二氧化硅处理，模拟体内巨噬细胞活化的作用过程。结果表明伴随着二氧化硅的处理，circHECTD1出现时间梯度的下降趋势。
图2 二氧化硅处理诱导circHECTD1表达下调（摘自(Zhou et al., 2018)）
circHECTD1参与调控巨噬细胞的活化作用
在RAW264.7细胞中过表达circHECTD1可缓解二氧化硅处理的效应。二氧化硅处理后RAW264.7细胞会在不同时间出现M1型或M2型的活化状态，但过表达circHECTD1可以缓解该作用过程。
图3 circHECTD1缓解二氧化硅诱导的巨噬细胞活化作用（摘自(Zhou et al., 2018)）
ZC3H12A参与circHECTD1介导的巨噬细胞活化调控作用途径
通过过表达和干扰实验证明ZC3H12A与二氧化硅介导的巨噬细胞活化作用有关，ZC3H12A通过结合circHECTD1而非HECTD1的mRNA发挥作用。
图4 ZC3H12A直接结合circHECTD1发挥作用（摘自(Zhou et al., 2018)）
二氧化硅可诱导HECTD1的表达
二氧化硅处理后RAW264.7细胞中HECTD1蛋白水平的增高，也可直接诱导HECTD1的mRNA表达增高。在小鼠体内矽肺模型中也得到了验证。
图5二氧化硅诱导促进HECTD1表达（摘自(Zhou et al., 2018)）
HECTD1 蛋白参与circHECTD1介导的巨噬细胞活化作用
过表达circHECTD1不直接影响线性的HECTD1的mRNA水平，但能明显降低HECTD1的蛋白水平。基于Cas-9基因打靶技术，作者设计了两种认为干预HECTD1蛋白水平的条件：ACT条件下促进HECTD1蛋白的表达，NIC则抑制HECTD1蛋白的表达。作者首先分析了这两种条件下巨噬细胞活化状态的差别。结果表明，过表达HECTD1蛋白的情况能促进M1和M2两种活化方式，而降低HECTD1蛋白水平则可显著激活M1型活化，抑制M2型活化作用。在二氧化硅处理条件下，过表达HECTD1蛋白能促进M1型活化，抑制HECTD1蛋白则不能产生该效应。说明HECTD1蛋白参与了二氧化硅诱导的巨噬细胞活化作用过程。结合过表达circHECTD1可以显著抑制HECTD1蛋白的表达水平的结果，在二氧化硅处理的条件下，circHECTD1表达下调，促进了HECTD1蛋白的水平，进而促进了巨噬细胞的活化。
图6 HECTD1 蛋白参与circHECTD1介导的巨噬细胞活化作用（摘自(Zhou et al., 2018)）
HECTD1介导ZC3H12A的泛素化作用
由于HECTD1是一种E3连接酶，有没有可能介导了ZC3H12A的泛素化作用？实验证明了该假设。基于CoIP实验证明HECTD1与ZC3H12A可相互作用。二氧化硅处理条件下，过表达HECTD1促进ZC3H12A的泛素化，抑制HECTD1则抑制ZC3H12A泛素化。
图7 HECTD1介导ZC3H12A的泛素化（摘自(Zhou et al., 2018)）
二氧化硅诱导HECTD1的升高与肺纤维化作用有关
二氧化硅刺激所导致的肺部纤维化是矽肺的重要病理特征，上述结果表明HECTD1蛋白在该过程中扮演了重要角色，有没有可能HECTD1与该病理变化也有关系？基于划痕实验，Transwell实验表明巨噬细胞经过二氧化硅处理后迁移能力明显增加，但在基于Cas-9介导的过表达和降低HECTD1蛋白的实验表明，HECTD1蛋白参与了该病理过程。
图8 HECTD1的升高与肺纤维化作用有关（摘自(Zhou et al., 2018)）
矽肺临床患者HECTD1蛋白增高
在临床标本中，作者分析了HECTD1蛋白表达情况，结果表明矽肺患者来源的巨噬细胞中HECTD1蛋白增高。
图9矽肺患者HECTD1蛋白增高（摘自(Zhou et al., 2018)）
circHECTD1在矽肺中的作用模型
综合本文的实验数据和结果，本文作者发现ZC3H12A可结合并稳定circHECTD1分子，在二氧化硅的刺激下，细胞中circHECTD1的表达显著下降，该下调作用使得HECTD1得以保留和增高，介导了ZC3H12A的泛素化降解作用，导致了巨噬细胞M1型活化状态和肺纤维化等病理进程。
图10 （摘自(Zhou et al., 2018)）
参考文献：
Zhou, Z., Jiang, R., Yang, X., Guo, H., Fang, S., Zhang, Y., Cheng, Y., Wang, J., Yao, H., and Chao, J. (2018). circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1/ZC3H12A-Dependent Ubiquitination. Theranostics 8, 575-592.