近年来，在无细胞再生医学领域，人间充质干细胞（hMSC）来源的外泌体可作为理想的治疗药物。但是器官靶向性差和治疗效果差是未来临床应用的关键问题。来自韩国国立首尔大学的Byung-Soo Kim教授的研究团队最近在Nano Letters杂志（IF=12.08）上在线发表了题为“Therapeutic Efficacy-potentiated and Diseased Organ-targeting Nanovesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells for Spinal Cord Injury Treatment”的研究。研究人员利用氧化铁纳米颗粒(IONP)处理hMSCs后，可制造含有IONP的类似外泌体的纳米囊泡(NV-IONP)，用于评估这种NV-IONP对于脊髓损伤(SCI)的治疗效果。相比于不含有IONP的NV，NV-IONP不仅包含用于磁铁导向的IONP，还携带着大量的治疗性生长因子到靶细胞。NV-IONP由于携带着的IONP在内体或者溶酶体的酸性条件下会被慢慢电离成铁离子，继而活化hMSCs中的JNK和c-jun信号通路，促进治疗生长因子的表达。体内回输NV-IONP的同时给予磁铁导向至脊髓，NV-IONP可以显著在损伤的脊髓聚集，增强血管形成、减轻局部炎症和减少损伤脊髓的细胞凋亡，从而改善损伤脊髓的功能。该研究进一步证明了经改造后的仿生NV-IONP对于治疗SCI具有增强的治疗效果和靶向器官效应，为修复损伤脊髓提供治疗新的备选药物。
氧化铁纳米颗粒IONP进入体内可以被离子化和同化吸收，并且已被FDA批准临床使用，可被外部磁场导向，从而作为NV-IONP的导航工具。IONP处理hMSCs后成为hMSC-IONP，IONP进入细胞内的内体和溶酶体后被离子化，活化JNK、c-jun通路，导致胞内的生长因子表达上调，再对hMSC-IONP细胞挤压后膜过滤，经密度梯度离心获得第二层的纳米囊泡，再经超离富集后磁铁吸附收集这种NV-IONP囊泡，体外磁场导向用于SCI回输治疗（a）。NV-IONP经磁场导向可以有效到达病灶，促进内皮细胞血管再生，促进星形胶质细胞分泌神经营养因子给神经元，防止神经元细胞过度凋亡，促进M1促炎型巨噬细胞转换成M2抗炎型巨噬细胞以抗炎症效应（b）。
- INOP被hMSC吸收后，hMSC内的血管生成、抗凋亡、抗炎和神经营养因子基因表达有什么变化？
电镜观察INOP的形态和胶体稳定性（a-i），以及吸收了INOP的hMSC-IONP细胞的形态（a-ii）。给予不同浓度的INOP处理hMSCs，CCK8检测发现其无明显毒性（b）。RITC标记INOP后，confocal荧光观察hMSCs摄取了INOP的变化（c）,摄取INOP后去掉含有INOP的培养基，换成新鲜培养基再继续培养24h和48h后，qRT-PCR检测在hMSCs中血管生成基因（Ang-1, FGF2, HGF, VEGF）,抗凋亡基因(FGF2, HGF, VEGF), 神经营养因子BDNF和抗炎因子TGF-β1的表达在48h后明显上调了（d）。同时利用WB技术在蛋白层面检测了JNK和c-jun的磷酸化， Ang-1, FGF2, HGF, VEGF，BDNF，TGF-β1的蛋白水平也明显上调了（f）。图e为INOP进入细胞内活化JNK和c-jun通路的原理示意图。
- 对hMSCs和hMSCs-INOP细胞来源的纳米囊泡NV和NV-INOP的鉴定
纳米囊泡NV和NV-INOP的电镜形态鉴定（a）; 电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)验证NV-INOP中包含铁离子的INOP（b）；外部磁铁吸附NV-INOP，证明其中含有铁离子的INOP（c）; NTA分析NV和NV-INOP的直径大小分布（d）；WB鉴定NV和NV-INOP含有外泌体特征性marker蛋白CD9和CD63（e）。RITC红色荧光标记INOP，DiO绿色荧光标记NV，confocal显微成像证明INOP存在于NV-INOP里面（f）； DiO标记NV，RITC和DiO标记NV-INOP，confocal显微成像证明NV和NV-INOP被小鼠巨噬细胞Raw 264.7摄取的情况（g）。qRT-PCR分析相比于NV，NV-INOP中的Ang-1, FGF2, HGF, VEGF，BDNF，TGF-β1的基因表达和蛋白水平也明显上调了（h, i），说明摄取了NV-INOP的hMSCs的相关基因和蛋白水平上调，同时其分泌的外泌体中的相关基因和蛋白水平也上调。
- NV和NV-INOP体外应用对内皮细胞、神经元细胞、星形胶质细胞和巨噬细胞的影响？
体外毛细血管形成实验检测，发现相比于NV组，NV-INOP刺激8h后更能促进DiI红色荧光标记的HUVECs的毛细血管形成和血管数量增加（a）; CCK-8实验检测，相比于其他组，NV-INOP处理后的HUVECs的增殖能力最强（b）；在LPS和缺氧条件下，FDA绿色标记活细胞，EB红色标记死细胞，相比于其他组，NV-INOP处理后的神经元样的PC12细胞的存活率明显升高（c）; 相比于其他组，NV-INOP处理后的星形胶质细胞会分泌和在mRNA水平表达更多的Ang-1, FGF2, HGF, VEGF，BDNF（d）; 相比于其他组，NV-INOP处理后的Raw 264.7表达的M1型巨噬细胞相关基因TNF-α 和 IL-6 下调，表达的M2抗炎型巨噬细胞相关基因Arg-1、CD206、IL-10、VEGF明显上调（e, f）。血管生成和炎症蛋白芯片分析，显示相比于其他组，NV-INOP处理组的M1型基因（IL-1β and MMP-9）下调，而M2型基因（VEGF and IL-10）上调（g）。总之，NV-INOP促进内皮细胞血管生成、防止神经元细胞凋亡、促进星形胶质细胞分泌营养因子和促进M1向M2型巨噬细胞转化以抵抗炎症的能力最强。 
- 体内应用NV和NV-INOP对于治疗SCI的效果是怎么样？
体内回输不同囊泡，24h后IVIS成像观察荧光在体内的各器官分布情况，在无磁场诱导（MF-）的情况下，NV-INOP很少聚集在受损的脊髓而是聚集在肝和肺器官；当在受损部位给予磁场引导（MF+），hMSC-IONP还是无法在受损的脊髓聚集，而NV-INOP则明显在受损的脊髓聚集（a）。hMSC-IONP在MF+ 或者 MF-情况下，体内分布无明显差异(b)；NV-INOP在MF+ 或者 MF-情况下，在受损的脊髓聚集的效果有明显差异（c、d）; 接下来作者分五组进行体内实验，(i) sham, (ii) injury + PBS, (iii) injury + NV, (iv) injury + NV-IONP (MF-), (v) injury + NV-IONP (MF+)，NV-INOP在MF+情况下到达靶器官受损脊髓，WB检测发现血管形成蛋白Ang-1、VEGF明显增加，而胶质细胞增生蛋白GFAP、MAP-2和凋亡蛋白C-Cas-3明显减少，同时炎症蛋白IL-6、TNF-α和IL-1β明显减少（e, f）。confocal显微成像检测NV-INOP在MF+情况下，促进NF神经元的存活和降低胶质细胞增生蛋白GFAP的水平（g）。NV-INOP在MF+情况下，SCI损伤28天后，可以很好地保护脊髓的结构（白灰色区域）不被破坏，减轻纤维化的区域面积（绿色虚线圆圈）（h）；同时给予BMS评分，发现NV-INOP在MF+情况下，可明显提高SCI后的BMS评分，显示脊髓的功能恢复得很好（j）。
- 整篇文章的研究与应用思路模型
参考文献
- Kim HY , et al.. Therapeutic Efficacy-potentiated and Diseased Organ-targeting Nanovesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells for Spinal Cord Injury Treatment. Nano Lett. 2018. DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b01816.