来自加拿大渥太华大学的Daniel Figeys教授团队最近在Nature Communications上在线发表题为“Metaproteomics reveals associations between microbiome and intestinal extracellular vesicle proteins in pediatric inflammatory bowel disease”的研究，本文充分运用了生物信息学统计和分析，通过收集儿科IBD人群的黏膜与肠腔交界处（MLI）样品，宏蛋白质组学分析揭示了在儿科炎症性肠疾病发生发展过程中，肠道分泌含有氧化抗细菌人源蛋白的EVs，引起微生物群发生氧化应激反应，分泌更多的H2S，加重黏膜炎症反应，引起微生物群失调，解释了肠道EV蛋白组改变后会导致IBD病人的宿主—微生物群异常互作的新机制。
炎症性肠疾病IBD的主要特征是肠道黏膜的炎症，包括克罗恩疾病CD和溃疡性结肠炎UC这两个子类型。这两种疾病类型有基本差异而可以区分，但是由于具有相似的临床表现，所以可以应用相似的治疗策略。IBD在发达国家很流行，发生率>0.3%，而发展中国家也开始流行。与成人型IBD不同，儿童型IBD的进展程度、解剖学定位和治疗预后不好，导致儿童生长障碍和长期健康状态不良的后果。虽然IBD潜在的具体发病机制还不清楚，但是影响它发病的因素是多样的，包括遗传易感性、免疫能力、环境因素和肠道微生物群。已有大量研究报道，IBD的发病与肠道微生物群的改变密切相关。之前的研究主要是对IBD病人的排泄物中的微生物进行分析，以研究发病机制，而儿童型IBD的黏膜相关微生物群失调很少能反映在粪便中。作者之前研究线粒体障碍和宿主与微生物对话异常在克罗恩疾病过程中作用时，直接采用的黏膜与肠腔交界处（MLI）吸取物进行分析。所以作者想通过这种有效的样品采集方法，解释IBD病人中肠道微生物群与宿主相互作用的复杂性，以及其在疾病过程中的作用。
对获取到的样本进行经典的DNA-或者RNA-seq分析微生物的组成和功能，可是基因或者转录本的存在不一定就反映了蛋白的表达，而直接检测蛋白表达丰度的宏蛋白质组学，可以提供更加准确的功能信息。基于质谱MS的蛋白组学分析可以同时检测宿主和微生物来源蛋白质，有助于更好地破译发病过程中宿主与微生物的关系。作者利用黏膜与肠腔交界处（MLI）吸取物分析方法，高通量MS和之前建立的MetaPro-IQ生物信息工作流程分析儿童型IBD病人中微生物群、人和EVs中的蛋白表达信息。
作者对25例CD病人、22例UC病人和24例无肉眼可见肠道炎症的非IBD人群来源的不同部位(回肠末端(TI)、升结肠(AsC)和降结肠(DeC)的)的176 个MLI样本进行基于MS的宏蛋白质组学方法分析，发现了229,996种多肽和53,207种蛋白（Table1，a）。重复性MS分析证明了MLI样本分析的质控过关，也表明该研究使用的MS分析和宏蛋白组学工作流程是可行的。来自人和微生物群的53,207种蛋白中，只有3488种来自宿主，其余的是来自微生物。但是人来源的蛋白占总蛋白密度的52%（b）,说明人来源蛋白种类少而量多。对CD和UC病人肠道不同部位的样本分析人源蛋白/微生物蛋白的比率，发现患有肠炎病人的样本中人源蛋白所占比重是明显升高的（c）。在CD病人，而不是UC病人中，人源蛋白在总蛋白中所占的比重与临床疾病严重程度成正相关（d）。
2. 儿科IBD的肠道MLI样品蛋白质组学谱发生改变
PCA主成分分析发现，在对照组 和IBD组之间中MLI样品中人源蛋白种类可以得到明显的区分，而在CD 和UC组之间中MLI样品中人源蛋白种类无法明显地区分。另外IBD且无炎症现象的样品点偏向于分布在对照组和IBD且有炎症现象组质之间（a）。相反的是，对照组样品的微生物蛋白与大多数IBD病人样品中的微生物蛋白分群在一起，只有少数IBD的不归类一起（b），而且与肠道部位和炎症有无也没直接的关系。MANOVA分析人源蛋白显示，无论是对照组与IBD（包括UC、CD）对比，还是对照组和IBD肠部位之间对比，样品中人源蛋白中存在明显的差异（c）。而 MANOVA分析微生物蛋白显示，只有对照组与IBD对比，样品中微生物蛋白中存在差异，而对于IBD的有/无炎症组之间对比，样品中微生物蛋白中无显著性的差异（d）
3. IBD发展过程中会提高微生物对于氧化应激的反应
为了评估微生物的功能，作者利用COG数据库对所有定量的微生物蛋白进行注释，获得了24个类别的2251个COGs。PLS-DA分析IBD病人微生物蛋白中特异性差异丰富的COGs，在IBD病人的DeC、AsC和TI三个部位，分别明确了71、61和63种差异丰富的COGs。其中54个COGs被明确存在至少2个部位，42个COGs被明确存在至3个部位。类别L的8个COGs功能与DNA复制、重组和修复有关，类别M的5个COGs功能与外膜成分合成有关，类别V的5个COGs功能与防御机制有关，类别X的4个COGs功能与mobilome（可移动遗传元件）有关（a）。相比对照组，IBD组中类别S和有关mobilome的目录X的LFQ密度得到明显上调，而且特别是有关mobilome的目录X中的4个COGs，其中2种是转座子，另2种噬菌体有关蛋白。而且作者还发现微生物蛋白中有2种有关于CRISPR/Cas系统的COGs在IBD中上调（b, c）。
4. IBD病人的微生物硫和半胱氨酸代谢发生改变
虽然IBD病人肠道中的硫酸盐还原菌数量和H2S的产生水平都是增加的，但是IBD儿童病人中调控H2S的产生的通路还不清楚。L-半胱氨酸是生成H2S 的底物，L-半胱氨酸脱硫酶可以催化L-半胱氨酸生成H2S和氨，而其蛋白水平在IBD病人的DeC 和AsC部位明显上调（3a）。KEGG注释分析发现了60条KOs，与912种属于硫代谢和半胱氨酸/蛋氨酸代谢通路相关的蛋白。Wilcoxon rank-sum test明确了在IBD病人中，有41种蛋白差异表达，18种蛋白下调和23种蛋白上调（a）。而相应的上调和下调的蛋白KOs在参与L-半胱氨酸代谢过程中发挥的作用（b）。因为L-半胱氨酸和硫化氢H2S在调控黏膜炎症过程中起重要作用，所以这提示可能是微生物的代谢通路改变影响了肠道生理状况和疾病进展。
5. CD病人胃肠道中的F. prausnitzii菌株类型发生改变
作者对MLI样本分析明确了289中微生物种类，包括细菌、真菌、古细菌和病毒。相比对照组，IBD病人的真菌丰度比例明显增加，其水平与CD病人AsC和TI部位的炎症严重程度成正相关（a-b）; 四个差异丰度表达的门类，如Proteobacteria, Verrucomicrobia, Ascomycota和 Spirochetes在IBD病人中明显上调，还有噬菌体Caudovirales在IBD病人中也上调了（c）。
Bacteroides和Faecalibacterium两个属改变程度最明显，在IBD病人中分别减少和增加了最明显。相比于对照组，Faecalibacterium属中主要的类别Faecalibacterium prausnitzii在UC和CD病人样本中具有相对高的丰度（d）。与前人研究一致，作者也发现在CD病人中，F. prausnitzii’s的亚型L2–6株的数量会增加，而A2–165株的数量会下降（e-f），可能是因为L2–6株编码代谢功能，以响应氧化应激，从而增加了其在IBD病人肠道的应激环境中存活可能性。
6. IBD病人的MLI样本中的宿主防御蛋白的水平上调
为了进一步明确对照组与IBD组、UC组与CD组病人中MLI差异表达的人源蛋白索契的作用，PLS-DA分析发现在DeC、AsC和TI部位中存在IBD相关的79、85、82种差异表达的人源蛋白（a），其中59种蛋白在肠道3个不同部位都表达差异。这59种蛋白的相互作用网络显示非常有意义的蛋白互作（b）,其中ITGAM、MPO和ITGB2展示了最高程度的互作频率; 同时对这59种蛋白进行GO富集分析，发现其大多数与细菌/真菌的免疫和防御反应有关（c）；另外大多数蛋白与胞外区域(51/59)或者胞外外泌体(50/59)有关（d）。研究中明确的3493种人源蛋白中，2340种蛋白可以在EVpedia外泌体数据库中找到，其中88种蛋白位于top 100种EV蛋白之中。而且相比差异丰度表达的EV蛋白也位于IBD病人的top 前100种差异丰度表达蛋白之中（e）。TEM鉴定发现样本中存在肠道胞外囊泡或者外泌体大小的颗粒。
接着作者分离对照组和IBD组病人的MLI上清的EVs，进行了TEM鉴定形态和NTA分析囊泡直径大小分布（f, g）,与外泌体、分泌的微囊泡和细菌外膜颗粒大小一致。蛋白组学分析EVs蛋白成分，发现2744种蛋白（1519种来自人，1225种来自微生物），微生物蛋白丰度占总蛋白12.6%，而且相比对照组，IBD组EVs中的微生物蛋白丰度更低。但是相比于对照组，IBD组的EVs总蛋白和丰度明显增加（i），可能是由于IBD病人的MLI人源蛋白水平增高。相应的EVs marker蛋白可以明显被检测到，而非EVs marker蛋白则无法被检测到或者蛋白水平很低。PCA分析，发现IBD组和对照组的EVs人源蛋白可以被明显分离（j）。
7. 本文的思路总结和主要发现
作者采用大规模的宏蛋白组学分析了儿科IBD人群的肠道微生物和其相关的人源蛋白。首先对早期IBD的MLI样本微生物的功能活性评估，明确了新的宿主—微生物相互作用特征，包括微生物mobilome和微生物代谢（特别是L-半胱氨酸代谢）的改变。另外，IBD病人肠道黏膜会分泌含有宿主防御蛋白（MPO、BPI活性氧化剂）的EVs，被微生物摄取后，引起微生物防御应激的反应和功能适应，从而导致肠道微生物群失调和后续的黏膜炎症的发展。本研究旨在提供了对IBD发生发展过程中，宿主—微生物群互作机制的有价值的蛋白水平信息。(小编认为这篇研究充分体现了生物信息学分析大数据的魅力，涉及到了多个热点关键词，胞外囊泡、宏蛋白组学、代谢、肠道微生物群)
参考文献
1. Zhang X, et al.. Metaproteomics reveals associations between microbiome and intestinal extracellular vesicle proteins in pediatric inflammatory bowel disease. Nat Commun. 2018 Jul 20;9(1):2873. doi: 10.1038/s41467-018-05357-4.