越来越多的研究表明，环状RNA在膀胱癌的发展中起着关键的调节作用，但是多种环状RNA在膀胱癌中的表达模式和具体作用仍待研究。2020年2月4日，一项由中山大学孙逸仙纪念医院带来的研究发表在Molecular Cancer上[1]，此项研究发现了在膀胱癌中的差异表达的circRIP2，且circRIP2的表达与膀胱癌的发展呈负相关，但是circRIP2却能通过激活miR-1305/ Tgf-β2/ smad3途径诱导EMT（上皮细胞-间充质转化）来发挥促癌作用。
- circRIP2的表达与膀胱癌的发展呈负相关。
首先，研究者通过设计环状RNA特有的Divergent引物电泳验证、Sanger测序和RNase R酶法鉴定了circRIP2，并在45对膀胱癌/癌旁组织中检测到了circRIP2的差异表达，发现circRIP2在癌组织中相对表达更低。随后，对58个膀胱癌组织进行circRIP2表达水平与肿瘤分级、分期及转移的相关性分析，对43例膀胱癌患者进行circRIP2表达水平与预后相关性分析，发现circRIP2表达与膀胱癌的发展呈负相关，circRIP2表达更高时患者预后更好。
图1 circRIP2的表达与膀胱癌的发展呈负相关[1]
- circRIP2促进膀胱癌发展。
研究者在两种膀胱癌细胞（5637、U3）中干扰和过表达circRIP2，并进行细胞功能验证。CCK8、克隆形成、Trans-well迁移侵袭及划痕实验结果表明，体外干扰circRIP2能够抑制膀胱癌细胞的增殖和转移；而体外过表达circRIP2则结果相反，表现为促进膀胱癌细胞的增殖和转移。为了评估circRIP2在体内的致瘤性，研究者应用了小鼠皮下成瘤模型，发现过表达circRIP2能够促进裸鼠的肿瘤形成。以上结果说明circRIP2能够促进膀胱癌发展。
图2 circRIP2促进膀胱癌发展（干扰验证）[1]
图3 circRIP2促进膀胱癌发展（过表达验证）[1]
- circRIP2通过吸附miR-1305提高Tgf-β2水平。
为了进一步确定circRIP2促进膀胱癌发展潜在机制，研究者通过RNA测序分析了过表达circRIP2后差异表达的基因，验证了表达上调的基因Tgf-β2，且通过细胞功能实验发现在过表达circRIP2的膀胱癌细胞中添加Tgf-β2抑制剂，能够显著抑制circRIP2对肿瘤的促进作用，说明circRIP2可能通过上调Tgf-β2的表达来促进膀胱癌的发展。
进一步研究circRIP2是如何上调Tgf-β2，研究者通过FISH及核质分离实验对circRIP2进行定位分析，发现circRIP2主要定位于细胞质，可能作为miRNA海绵发挥作用。随后，对circRIP2可能结合的miRNA进行生物信息学预测，结合RNA pulldown技术、双荧光素酶报告实验筛选出与能够与circRIP2 结合的miR-1305。同时也通过双荧光素酶报告实验和WB实验，验证了miR-1305与其预测的下游靶基因Tgf-β2的结合作用。
以上结果说明circRIP2能够吸附miR-1305来提高膀胱癌细胞中Tgf-β2水平。
图4 circRIP2通过吸附miR-1305提高Tgf-β2水平[1]
研究者在膀胱癌细胞中同时过表达circRIP2和miR-1305，进行细胞功能实验，结果表明miR-1305能在circRIP2过表达的基础上抑制细胞的增殖和转移，说明miR-1305能够逆转circRIP2对肿瘤的促进作用；且miR-1305自身也表现为显著抑制细胞增殖和转移。
图5 rescue实验证明circRIP2与miR-1305在肿瘤发展中的调控关系[1]
- circRIP2通过Tgf-β2/smad3途径激活EMT
Tgf-β信号传导在癌症发展中起着最终作用，而癌症中增强Tgf-β信号传导可促进EMT。研究者通过WB检测过表达circRIP2的膀胱癌细胞中上皮标志物和间质标志物，发现上皮标志物E-cadherin表达降低，间质标记物Tgf-β2、N cadherin和Vimentin表达增加；而在膀胱癌细胞中同时过表达circRIP2和miR-1305时，circRIP2诱导的间充质表型被逆转，说明在膀胱癌中circRIP2能通过吸附miR-1305升高Tgf-β2水平来促进EMT。
有效的Tgf-β信号传导还需要smad途径，研究者发现过表达circRIP2后，膀胱癌细胞中smad3及其磷酸化水平显著升高，但对smad2及其磷酸化无明显作用；而同时过表达circRIP2和miR-1305时，circRIP2诱导的smad3和p-smad3表达升高被逆转。当抑制Tgf-β2时，smad3及其磷酸的激活均被抑制。
以上结果说明circRIP2能够通过Tgf-β2/smad3途径激活EMT。
图6 circRIP2通过Tgf-β2/smad3途径激活EMT [1]
- 讨论
该研究表明，circRIP2能够通过激活miR-1305 /Tgf-β2/ smad3途径诱导EMT来发挥促癌作用，说明circRIP2可能是膀胱癌患者的潜在生物标志物和治疗靶标。然而，circRIP2在临床水平上却起着抑癌作用，意味着circRIP2可能在膀胱癌调控过程中存在更多的分子机制，最后研究者也补充阐明了致癌性circRIP2可能是通过与肿瘤微环境交流来发挥抑癌作用。
参考文献
- Yinjie Su., et al., circRIP2 accelerates bladder cancer progression via miR-1305/ Tgf-β2/ smad3 pathway. Mol Cancer. 2020; 19: 23.