阿尔茨海默病（AD）是一种与进行性记忆、思维和行为能力丧失相关的最常见的痴呆病。AD作为一种与衰老相关的神经退行性疾病，其已知最大的危险因素是增长的年龄。大量研究都认为淀粉样β肽（Aβ）累积和tau蛋白过度磷酸化导致AD。据报道，参与APP蛋白水解过程的APP基因突变会加速了Aβ肽的积累。Aβ肽聚合成有毒的寡聚体并聚集成不溶性淀粉样斑块，并通过GSK3β活化引起tau蛋白过度磷酸化，随后在神经元内形成的神经原纤维缠结引发了一系列事件，最终导致神经元死亡。这种阿尔茨海默病被称为家族性阿尔茨海默病（fAD）。由于它在较早的年龄发展，也被描述为早发性家族性阿尔茨海默病（EFAD），但这种类型的AD占所有AD患者的比例低于1-5％。
其实，最常见的AD形式是迟发性阿尔茨海默氏症（LOAD），通常出现在65岁及以上的人群中。由于这种类型AD的遗传原因尚不清楚，所以它通常被称为散发性AD（sAD）。
尽管fAD和sAD之间存在差异，但它们具有共同的症状，导致脑损伤逐渐增加。 fAD和sAD的病理学标志分别是由Aβ积聚和tau过度磷酸化引起的斑块和缠结。 LOAD发展和进展的确切机制还未明确，此外， LOAD中Aβ积累的机制也是不清楚的。
环状RNA（circRNA）是进化保守的转录物，其通过5’和3’末端反向剪接从前mRNA衍生而来。circRNA在神经元中表达丰富。有趣的是，脑circRNAs在多种生物的衰老过程中受到调节，这表明circRNAs在脑老化和与衰老相关的神经退行性疾病中发挥着潜在的作用。
来自德国马克斯普朗克衰老生物学研究所的研究者于biorxiv网站在线发表的题为“The role of Aβ circRNA in Alzheimer’s disease: alternative mechanism of Aβ biogenesis from Aβ circRNA translation”的研究，发现了在阿尔茨海默病发病过程中Aβ circRNA可以形成Aβ肽的新机制，同时也揭示了circRNA可以翻译蛋白，这一重要功能对于生理或者病理过程的重要作用。（PS：该研究是研究人员的新发现，暂时未发表于任何正式杂志，原文需到biorxiv网站下载）
作者对两种可能形成Aβ肽的机制进行总结：左边是已有大量研究对家族性AD中Aβ肽形成机制的描述；右边则是本文发现的Aβ circRNA-a形成Aβ肽的新机制具体描述。
1. 通过深度测序数据分析APP基因来源的circRNAs
通过已有研究中的深度测序数据进行分析，挖掘到了人淀粉样前体蛋白APP基因来源的几种circRNAs，其中一种是包含Aβ肽ORF的circRNA（hsa_circ_0007556）。利用反向引物RT-PCR人脑样本来源的总RNA，电泳结果发现扩增产物中存在多种不同长度的APP基因来源的几种circRNAs（A）。同时对PCR扩增产物再次进行深度测序分析，发现了16种Aβ肽circRNAs，hsa_circ_0007556（Aβ circRNA-a）也包括在其中；对RNase R处理后的人脑组织来源的总RNA也经过上述相同处理，也可以发现这16种Aβ肽circRNAs中有15种是一样的，另外也发现了一种新的Aβ肽circRNA（table 1）。
在这些Aβ肽circRNAs中，Aβ circRNA-a含量最丰富，因此被选为后续Aβ circRNA功能研究的主要靶点，其RT-PCR扩增产物被克隆进入pCMV-MIR载体进行体外过表达后的功能验证。
2. 体内证实Aβ circRNA-a的存在并构建过表达载体进行研究
利用特异性引物对人脑额叶和海马组织来源的总RNA进行RT-PCR检测，明确了Aβ circRNA-a存在于人脑组织中（A，C）；为进一步探索Aβ circRNA的功能，作者通过内含子介导增强circRNA体外表达策略（后续会分享这种方法），体外构建了pCircRNA-BE-Aβ-a 和 pCircRNA-DMo-Aβ-a过表达载体（B），转染至HEK293后，RT-PCR检测发现其表达量分别增加了2185和3268倍(D），剪切位点序列与野生型Aβ circRNA-a一致，电泳明确了Aβ circRNA-a载体的过表达情况(C)，Sanger测序证明体外这种过表达的Aβ circRNA-a与天然产物的序列一致，Northern印迹实验也证明了Aβ circRNA-a体外过表达成功，RNase R处理证明其对该酶的耐受性，最重要的是，这两种过表达载体只会产生Aβ circRNA-a，而不会产生成熟线性RNA，造成产物污染，以保证后续功能验证的有效性；另外Aβ circRNA-a体外过表达并不会影响HEK293细胞内源性APP mRNA的表达。
3. 体外过表达的Aβ circRNA-a具有蛋白翻译功能
由于之前有研究报道某些circRNAs能被翻译成蛋白，而Aβ circRNA-a中包含基因ORF序列，所以作者通过构建载体于体外过表达Aβ circRNA-a后，WB检测到细胞中Aβ肽的表达条带约为15-20kDa，产物被称为Aβ circRNA-a-DP，其中在HEK293细胞可检测到Aβ circRNA-a的本底表达，而pCircRNA-DMo-Aβ-a载体过表达效率最高。有趣的是，作者发现Aβ circRNA-a的表达差异大，而其对应的Aβ circRNA-a-DP蛋白翻译水平差异不一定打， 说明存在未知的调控机制在调控circRNA的蛋白翻译。
4. Aβ circRNA-a可以形成Aβ circRNA-a-DP，最后形成Aβ肽？
Aβ circRNA-a可以被翻译成Aβ circRNA-a-DP蛋白，其序列中含有β和 γ-分泌酶剪切位点，提示Aβ circRNA-a-DP很有可能经过β和 γ-分泌酶蛋白水解过程形成Aβ肽。通过IP-WB实验检测到Aβ circRNA-a过表达的HEK293细胞上清中存在Aβ肽，其Aβ肽表达差异水平与Aβ circRNA-a-DP蛋白水平差异趋势几乎一致，说明表达上调的Aβ肽很有可能来自Aβ circRNA-a-DP。
5. Aβ circRNA-a形成Aβ肽，那么Aβ肽最终会形成Aβ斑块？
Aβ肽形成Aβ斑块是AD疾病的标志，既然Aβ circRNA-a可以形成Aβ肽，那么这Aβ肽是否可以形成Aβ斑块。作者通过体外电转染pCircDNA-DMo-Aβ-a质粒到小鼠胚胎神经元培养10天后，IF检测到相比于对照质粒组，pCircDNA-DMo-Aβ-a转染组的神经元出现Aβ斑块信号（红色荧光），绿色荧光为神经元，这提示在原代神经元中过表达Aβ circRNA-a后可以形成Aβ斑块。
6. Aβ circRNA-a过表达后形成的Aβ肽，对下游信号通路的影响？
在HEK293细胞中转染两种载体后过表达Aβ circRNA-a，WB检测发现其都能明显增强GSK3β蛋白、Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表达水平，其中pCircRNA-DMo-Aβ circRNA-a质粒过表达后促进相关蛋白表达效率相比高点，提示过表达Aβ circRNA-a可以明显上调GSK3β蛋白表达和增强tau蛋白磷酸化。
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原文链接：https://www.biorxiv.org/content/early/2018/09/05/260968