来自宾夕法尼亚大学的华人科学家——siyang Zhang 教授在美国著名化学期刊JACS（IF= 13.858）于5月29日在线发表题为“Self-Assembly of Extracellular Vesicle-like Metal.Organic Framework Nanoparticles for Protection and Intracellular Delivery of Biofunctional Proteins”的论文，介绍了研究团队在体外借助外泌体膜、MOF基质、Zn+离子、有机配体，将靶向治疗肿瘤的蛋白包装在仿生纳米颗粒中，用于体内安全和高效地运输目的蛋白至肿瘤细胞胞浆内，可以有效地杀伤和治疗肿瘤的研究。该研究揭示了外泌体可用于构建仿生纳米平台，同时也为解决系统性和胞内运输蛋白提供了新的解决方案。
蛋白质参与代谢、信号传导、基因调控和免疫反应等生理过程，其功能的改变和缺陷会引发不同的疾病。胞内传递蛋白质治疗疾病，具有特异性高、毒性低、短暂性调控细胞功能、不改变遗传基因的优点。但是由于蛋白质很难穿透细胞膜和容易在血液中发生降解和变性，所以如何有效地和靶向性运送治疗蛋白质到肿瘤是一个难题。目前解决这个难题的方法就是在蛋白质上整合一些细胞膜通透的分子或者采用功能性纳米载体转运蛋白质。采用聚合物胶囊包裹功能性蛋白质。可以减轻蛋白质的降解的情况，但是这种胶囊装载蛋白质的效率和能力是比较低的，会限制临床大量使用蛋白的情况。而且这种聚合物载体属于外源性异物和缺乏靶向性分子，在血液运输过程中，其容易被巨噬细胞系统识别并吞噬，大大降低载体运送到靶器官的效率。
作者设计一种理想的运送载体，其具有装载蛋白质的高效率性和能力，并可以保护蛋白质免受血液中蛋白酶的降解和吞噬细胞的吞噬作用，选择性运送蛋白质到靶器官并释放到胞浆中。最新开发的一种生物相容性的仿生纳米运送系统，其由PH敏感性的金属有机配体框架纳米颗粒和包裹在纳米颗粒表面的天然胞外囊泡膜EVM组装而成。如图1所示，由Zn+金属离子和有机配体2-甲基咪唑组装形成的的MOF基质包裹蛋白质形成MOF-蛋白质纳米颗粒（MP）。这个MP颗粒有很大的内在表面和非共价键亲和能力，所以其蛋白装载效率高达94%，装载能力高达41%。MP颗粒被细胞内吞后，PH敏感的金属与有机配体共价键被破坏，释放蛋白质到内体或者溶酶体中，破坏溶酶体膜的稳定性。
天然的胞外囊泡表面包含整合素相关的跨膜蛋白CD47，可以介导“不要吃我”的信号，具有逃避吞噬作用，同时同一细胞来源的外泌体表面锚定分子会增强同型细胞对其的内吞作用。因此作者才设计利用天然胞外囊泡膜（EVM）包裹MP颗粒组装成EMP颗粒，可以避免血液中吞噬细胞的吞噬，并靶向特异性器官的运送，穿透细胞膜障碍，达到有效系统性地运送蛋白质到胞浆中发挥作用的目的。
图1 构建EMP纳米颗粒用于靶向和胞内转运蛋白质到同型细胞的准备过程的示意图
文章中作者采用一种干扰rRNA的N-糖苷酶用于肿瘤治疗的蛋白质gelonin，胞外囊泡膜来源于MDA-MB-231肿瘤细胞分泌的外泌体膜，组装成的EV-MOF-protein（EMP颗粒），进行体内和体外的功能学验证。
1. MP颗粒和EMP纳米颗粒的组装、优化和表型鉴定
调节组装时蛋白质和有机配体的浓度，可以优化MP纳米颗粒的形态和直径大小。作者首先尝试过包装BSA蛋白后，FTIR光谱检测到蛋白和MOF基质组成后，MP颗粒出现了MOF本来没有的大概在1667 cm.1 (C=O)的蛋白吸收峰（图2A），说明蛋白装载成功了。N2吸附-去吸附等温线揭示了MP纳米颗粒与MOF纳米颗粒有着相似的多孔结构。MP纳米颗粒空腔体积的减少是由于框架结构中封装的蛋白质造成的（图2 B）。MP纳米颗粒中的蛋白质的PH反应性释放动力学显示，运载蛋白在PH=5.0时释放出来更多（图2C）。MP, EVs, EVM和 EMP纳米颗粒的透射电镜形态鉴定图（图2 D-G）。绿色荧光标记的confocal结果显示了BSA蛋白和红色荧光标记的EVM包裹膜共定位（图2 H）。SDS-PAGE电泳结果显示，（1）代表marker，（2）代表EVs，（3）代表EVM，（4）代表不装载蛋白的仿生纳米颗粒，（3）和（4）有着相似的蛋白分子大小分布，而不带有除了EV膜外的蛋白（图2 I）。动态光散射（DLS）检测发现EMP颗粒的直径大于MP颗粒直径大小，说明EVM包裹MP颗粒（图2 J,K）。EVs, EVM和 EMP纳米颗粒的zeta 电位几乎相同，说明他们很稳定不分解，而MP颗粒zeta电位说明不稳定（图2 L）。
图2 仿生纳米颗粒的组装和表型鉴定
2. 仿生EMP颗粒可以减少表面介导的调理作用和防止被吞噬
体外纳米颗粒与IgG共孵育说明EMP吸附最少的介导调理作用的荧光标记的IgG（图3 A, B）。体外纳米颗粒与RAW264.7小鼠巨噬细胞共孵育后，cofocal结果显示EMP被巨噬细胞吞噬的情况最少，脂质体包装MP的LMP次之，MP最多（图3 C）。同时流式检测巨噬细胞中吞噬的荧光蛋白，证明了与confocal一样的结论（图3 D，E）。
图3 仿生EMP颗粒减少表面介导的调理作用和防止被吞噬
3. EMP纳米颗粒可以靶向性同一EVM来源的MDA-MB-231肿瘤细胞，辅助运送蛋白质到胞浆中
通过低渗处理后获得MDA-MB-231肿瘤细胞来源外泌体的EV膜，与MP颗粒体外组装成的EMP仿生纳米颗粒后，将这样的EMP仿生纳米颗粒与各种MDA-MB-231, 293T, 3T3, CAD, MCF-7和 SY5Y细胞系共孵育2h后，confocal观察发现EMP纳米颗粒吸附MDA-MB-231肿瘤细胞后被摄取的情况最多，流式结果也显示MDA-MB-231肿瘤细胞摄取EMP纳米颗粒后的荧光强度最高（图4 A-C）。流式检测bare protein, MP, EMP和LMP纳米颗粒被MDA-MB-231肿瘤细胞摄取的情况，发现EMP介导蛋白转运到肿瘤细胞的效率最高（图4D）。
图4 装载蛋白的EMP被肿瘤细胞摄取后的情况
4. EMP纳米颗粒被内吞和其包裹蛋白在胞内释放的机制
EMP与MDA-MB-231乳腺癌细胞共孵育时，给予不同的抑制细胞内吞的抑制剂刺激，流式检测发现抑制动力蛋白的DYN 和抑制胆固醇介导的内吞的MBD抑制剂处理后，乳腺癌细胞摄取的带荧光蛋白质有减少，说明乳腺癌细胞摄取EMP颗粒主要是通过动力蛋白依赖和胆固醇介导内吞的途径介导的（图5A）。红色荧光标记内体marker，绿色标记蛋白质，在30min EMP纳米颗粒吸附到细胞膜，在2h 蛋白质进入内体，在4h 大量蛋白质离开内体，最后慢慢弥漫到胞浆中（图5B）。早期内体PH为6.0−6.5，晚期内体或者溶酶体的PH为4.5-5.5，由于EMP颗粒中的PH敏感的MOF基质释放有机配体2-甲基咪唑，其质子化过程中会提高PH，会导致溶酶体膜通透性增强，促进内容物的释放。采用一种比率计染料(Lysosensor Yellow/Blue DND-160)检测溶酶体PH的变化，发现肿瘤细胞与EMP共孵育4h后，溶酶体的PH明显升高，同时confocal结果也显示同样的结论（图5C, D），提示通过质子化海绵作用干扰内体的PH，影响内体膜的通透性，从而导致包装蛋白质从其中释放出来。
图5 肿瘤细胞通过内吞途径，内化EMP纳米颗粒
5. EMP纳米颗粒回输治疗抑制小鼠异体移植肿瘤的生长
尾静脉回输装载ICG荧光标记的gelonin蛋白的EMP纳米颗粒治疗乳腺癌，1h, 4h, 8h, 24h, 48h 和72h后体外荧光成像发现，4h后蛋白质可以累积在肿瘤处，而随着时间延长，72h才慢慢消失（图6A, B）。I代表gelonin蛋白质，II代表EMP纳米颗粒，III代表MP颗粒。不同的回输治疗3天后，取出器官体外荧光成像发现，EMP回输组肿瘤的荧光强度最高（图6 C, D）。Confocal观察肿瘤冰冻切片的结论和体外成像一致（图6 E），说明EMP纳米颗粒回输治疗肿瘤可以很好地保护装载的蛋白质不被蛋白酶降解，同时靶向运输治疗性的蛋白质到肿瘤组织中发挥治疗作用。
图6 回输EMP颗粒后，肿瘤组织中累积大量的治疗性蛋白质
回输PBS, gelonin, MP和EMP纳米颗粒治疗乳腺癌，载有gelonin 蛋白的EMP纳米颗粒回输后明显抑制肿瘤的生长，MP颗粒次之，而都不会影响小鼠的体重（图7 A, B）；另外EMP纳米颗粒回输处理后，肿瘤体积大小和重量都是最小的（图7 C, D）。由于gelonin 蛋白可以干扰rRNA，促进肿瘤细胞的凋亡，所以H&E染色和TUNEL染色后检测肿瘤细胞的凋亡 ，发现载有gelonin 蛋白的EMP纳米颗粒回输组明显促进了肿瘤细胞的凋亡，而且对其他的心、肝、肺、脾和肾等器官中细胞没有明显的影响（图7 E-H）。
图7 系统性回输装载治疗性蛋白质的EMP颗粒可明显抑制肿瘤生长
总结： 作者开发了一种金属离子和有机配体结合后装载治疗性蛋白质框架的仿生纳米颗粒，外面再包裹一层天然乳腺癌来源的EV膜，用于系统有效地运送蛋白质到靶器官，从而治疗肿瘤。仿生纳米颗粒EMP的蛋白质装载效率高达94%，装载能力达41%，而且不影响蛋白质的功能。血液运输过程中纳米颗粒EMP保护运送蛋白质不受蛋白酶降解和不被吞噬细胞所吞噬，选择性运送到乳腺癌移植瘤处，可以有效地促进肿瘤凋亡，抑制肿瘤的生长。这种仿生的方法有别于传统的脂质体载药的模型，采用外面包裹的EV膜是很重要的创新点，它起到很好的保护作用，同时乳腺癌来源的EV膜还可以辅助靶向乳腺肿瘤细胞，促进内吞纳米颗粒，更有效地释放蛋白质到胞浆。这让我们展望这种EMP颗粒是否可以更好装载siRNA、化疗药靶向器官，达到治疗肿瘤的目的。
参考文献
1. Cheng G, et al. Self-Assembly of Extracellular Vesicle-like Metal-Organic Framework Nanoparticles for Protection and Intracellular Delivery of Biofunctional Proteins[J]. J Am Chem Soc. 2018. Doi: 10.1021/jacs.8b03584.