来自意大利人文研究医院的研究人员最近在Circulation Research（IF=15.211）上在线发表了题为Circ_Lrp6, a Circular RNA Enriched in Vascular Smooth Muscle Cells, Acts as a Sponge Regulating miRNA-145 Function的研究，介绍了在血管平滑肌细胞（VSMCs）中低密度脂蛋白受体相关蛋白6（Lrp6）来源的circ_Lrp6，作为miR-145的海绵，上调其靶基因ITGβ8, FASCIN, KLF4, Yes1和Lox的表达；另外体内敲低circ_Lrp6表达，可以明显预防血管内膜增生，进而影响血管疾病的发病过程【1】。
通过生物信息学方法筛选VSMCs circRNA
作者对Hall IF等人研究【2】中的人VSMCs 转录组数据集进行深入DCC分析circRNAs种类，发现80% circRNAs是由编码蛋白的外显子组成的；为了了解小鼠和人VSMCs circRNAs 种类是否相似，RNA-seq分析了主动脉的平滑肌层组织，发现了小鼠VSMCs 来源的circRNAs的来源和组成与人VSMCs的分析结果相似。miR-145-5p, miR-143-3p,
miR-221-3p/222-3p, miR-21-5p, miR-29-3p, miR-26-5p, miR-133a-3p和 miR-1-3p都是一些已被报道在VSMCs中表达较高的miRNA，下一步则筛选出与这些miRNA有至少两个以上结合位点的circRNA，其中与miR-145-5p有至少7个结合位点的circ_Lrp6，在人和小鼠之间的保守性最高，提示其具有进化保守的生理功能。在结构上，circ_Lrp6来源于低密度脂蛋白受体相关蛋白6（Lrp6）的4,5,6,7号外显子。
RT-PCR检测发现利用针对剪切位点的反向引物只可以在cDNA模板上扩增出circ_Lrp6；在RNase R 和放线菌素D处理下，circ_Lrp6表达水平依然稳定；Sanger测序证实了circ_Lrp6的头尾剪切位点序列的存在，这些实验证明了circ_Lrp6的存在，且属于环状RNA。RT-qPCR对小鼠不同组织和器官的表达分析，发现circ_Lrp6主要在脑、左心室和主动脉组织中高表达。原位杂交实验也证明了circ_Lrp6在冠状动脉、脑血管和主动脉中的高表达情况。
FISH实验和核浆成分分析实验证实了circ_Lrp6和miR-145的共定位，主要位于胞浆之中；为了评估circ_Lrp6对miR-145功能活性的影响，通过luciferase reporter实验证明只有WT circ_Lrp6可以逆转miR-145对靶基因Itgβ8 3’UTR的转录活性的抑制效应。敲低circ_Lrp6表达明显抑制含有正常miR-145结合位点的Itgβ8 3’UTR的转录活性，不会影响含有已被突变的miR-145结合位点的Itgβ8 3’UTR的转录活性；在蛋白水平，WB实验证明了敲低circ_Lrp6表达可以明显抑制miR-145靶向的ITGβ8，FASCIN和KLF4的蛋白表达。
因为argonaute 2 (AGO2)一般可以介导circRNAs和miRNAs的结合。在过表达circ_Lrp6和三种miRNA的细胞中，进行AGO2的免疫沉淀实验，发现在miR-145过表达组的沉淀复合物中的circ_Lrp6表达水平最高；利用circ_Lrp6探针的免疫沉淀实验，证明了circ_Lrp6主要富集miR-145，而不是其他miRNAs。对每ug总RNA中ncRNAs比例分析，发现miRNA-145/circ_Lrp6的比例约为3：1，符合circ_Lrp6作为miR-145 sponge的结论。原位杂交实验进一步直观地证明了60%的VSMCs细胞中存在circ_Lrp6与miR-145的共定位，而且85%的两者的共定位点是位于胞浆中miRNA调控mRNA降解的场所——P-bodies。STED超分辨率显微成像也证明了circ_Lrp6与miR-145的物理相互作用。
敲低circ_Lrp6表达抑制VSMC的迁移能力（划痕实验），降低细胞周期中S期的百分比，抑制细胞的增殖能力（cell number counting）,还可以明显上调了VSMC分化标志物——Acta2 和 Sm22的表达水平。
Rescue实验证明circ_Lrp6与miR-145的调控关系
在敲低circ_Lrp6表达的VSMCs基础上抑制miR-145，可以逆转细胞增殖和迁移能力被抑制的效应，明显促进细胞的增殖，提高细胞的迁移能力，上调原本被miR-145靶向抑制的Fascin/lox/Yes1基因的表达，但抑制细胞分化标志物——Acta2 和 Sm22的表达。另外在gain of function实验中，过表达circ_Lrp6明显租金细胞的增殖和迁移能力，同时也促进被miR-145靶向抑制的Fascin/lox/Yes1基因的表达。
VSMCs中circ_Lrp6 和miR-145表达水平的相关性
PDGF-BB和TGF-β是两个非常重要的影响VSMC分化的细胞因子。给予两种细胞因子处理VSMC 24h后，细胞circ_Lrp6的表达水平都是下调的，而PDGF-BB抑制miR-145表达，TGF-β则促进miR-145表达，另外母系基因Lpr6的表达情况与circ_Lrp6的表达相似。为了解在病理条件下，circ_Lrp6 和miR-145的表达水平是否会发生变化，缺氧处理VSMC可以明显下调miR-145的表达水平，而circ_Lrp6的表达水平无任何变化。
小鼠模型分析：作者采用了三种血管疾病的小鼠模型：ApoE-/-小鼠给予正常饮食（CD）和高胆固醇饮食（WD）用于构建高胆固醇血症导致动脉粥样硬化的模型；主动脉弓经主动脉狭窄导致压力过载性的心衰模型（TAC）；腹主动脉到两个肾的血管被封闭其中一端后，发展为系统性慢性高血压的模型（IP）。动脉粥样硬化的小鼠模型的主动脉中miR-145表达明显下调，而circ_Lrp6表达水平无明显变化，可以是由于PDGF-BB和缺氧诱导信号通路导致两者的表达无明显相关性（A-B）；在TAC模型的主动脉中miR-145表达也是明显下调，而circ_Lrp6表达水平无明显变化（C-D）；而在系统性慢性高血压的模型中miR-145表达则明显上调（这可能与TGF-β信号通路参与高血压发生有关，与体外TGF-β处理后的结果一致），而circ_Lrp6表达水平无明显变化（E-F）；
人类疾病模型分析：对患有动脉瘤的患者的腘动脉检测，发现miR-145表达也是明显下调，而circ_Lrp6表达水平无明显变化，与小鼠的结果有相似之处（G-H）。为了更直接地探究circ_Lrp6是否会调控血管疾病的发展，诱导ApoE-/-小鼠颈动脉狭窄后，给予circ_Lrp6-shRNA病毒敲低circ_Lrp6的表达后，可以明显抑制颈动脉狭窄导致的内膜增生程度。
总之，在小鼠和人的血管疾病过程中，miR-145和circ_Lrp6的表达水平是存在差异调控的，而调节circ_Lrp6的表达可以影响到血管疾病的发展。在VSMCs中，circ_Lrp6具有促细胞增殖的效应，而miR-145具有促细胞分化的效应。当血管疾病发生发展的时候，内膜增生，血管平滑肌细胞中的miR-145表达下调，circ_Lrp6的表达可不发生改变。而当人为地敲低circ_Lrp6的表达，则上调miR-145的表达，进一步抑制内膜增生的程度，抑制血管变窄导致的后续血管疾病的发生发展。
参考文献
- Hall IF, et al. Circ_Lrp6, a Circular RNA Enriched in Vascular Smooth Muscle Cells, Acts as a Sponge Regulating miRNA-145 Function. Circ Res. 2018 Nov 30. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.118.314240.
- Ballantyne MD, et al. Smooth Muscle Enriched Long Noncoding RNA (SMILR) Regulates Cell Proliferation. Circulation. 2016;133:2050-65.