5月17日，Genes & Development杂志在线发表了宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Jeremy E. Wilusz博士为通讯作者的文章，介绍发现了一种调控circRNA转录后出核的机制[1]。
目前circRNA研究已经受到国内外学者的持续关注，但一些重要的circRNA相关的基本科学问题尚未得到有效解决，其中就包括circRNA的转录后出核等亚细胞定位的机制。本文作者首先在果蝇中基于shRNA筛选，发现干扰Hel25E后明显导致核内circRNA的富集，进一步验证后表面果蝇中Hel25E是介导circRNA转录后出核的重要调控因子。作者进一步在人的细胞中分析Hel25E的同源分子的作用情况，结果表面Hel25E的同源蛋白UAP56 (DDX39B) 和URH49 (DDX39A)均可介导circRNA的出核，更有趣的是，UAP56主要负责大分子量的circRNA的出核，而URH49主要负责小分子circRNA的出核[1]。这一重大发现初步揭示了circRNA转录后出核的机制，为进一步探索circRNA亚细胞定位的机制提供了重要参考依据，是circRNA机制研究的重大进展。
作者如何筛选到circRNA 出核相关的基因的？
在果蝇DL1细胞中利用组分分离技术分离胞质与核成分，QPCR和Northern杂交进行circdati和circlaccase2含量的鉴定。基于这一定量分析体系，作者针对26个与RNA核输出有关的蛋白设计了shRNA，分析干扰后胞质与核中circRNA含量的差异。有趣的是在干扰Hel25E后，circdati出现明显的核内富集，而circlaccase2并不受影响。
图1 果蝇中干扰Hel25E明显影响circdati输出至胞质 （来自[1]）
这个现象是由于脱靶效应等非特异性的因素导致的吗？作者首先明确了干扰Hel25E不会影响circdati和circlaccase2的表达量。更进一步，作者用不同的shRNA以及对所设计的shRNA不敏感的Hel25E表达载体rescue实验，外源构建的过表达circdati载体均能够重复这一结果，说明所发现的现象是非常稳定的。
图2 干扰Hel25E影响circdati核输出不是非特异的现象 （来自[1]，排列略有改动）
Hel25E 只调控大于800nt的circRNA 出核
同样是circRNA分子，为什么在干扰Hel25E后circdati不能出核而circlaccase2却没有受到影响呢？为了找到可能的规律，作者进一步分析了其他12种circRNA分子，发现了一个规律：只有circRNA的长度大于800nt的时候才会因为干扰Hel25E而导致不能顺利出核。由于circRNA分子相对稳定，会不会由于细胞累积效应（降解速率不一致）而影响最终得出的结论？于是作者进一步通过4sU掺入法分析了新生circRNA的亚细胞定位情况。4sU可以在RNA转录的过程中掺入到新生成的RNA分子中，基于这一特性，可以有效识别出新生RNA分子。结果表明除了PlexA，其他circRNA的出核全部受到干扰Hel25E的影响。相应的circRNA在回补Hel25E及circRNA过表达的载体也能得到一致的结果。充分说明所观察现象是非常稳定的，不是非特异性的现象。
图3 长度大于800nt的circRNA出核受Hel25E调控 （来自[1]）
人类Hel25E同源蛋白作用如何？
人类基因组中与果蝇Hel25E同源的蛋白有两个：UAP56 (DDX39B) 和URH49 (DDX39A)。作者挑选了14种人的circRNA进行鉴定，分别干扰UAP56和URH49，看这些circRNA的出核是否受到影响。有趣的是，作者发现干扰UAP56和URH49后受影响的circRNA恰好相反：干扰UAP56主要影响大分子量的circRNA（大于1298nt），而干扰URH49责主要影响小分子的circRNA（小于356nt）。411-1099nt长度的circRNA规律不明显，说明还存在其他未知的作用机制。
图4 UAP56和URH49分别调控大分子量和小分子circRNA出核 （来自[1]）
四个氨基酸的差异导致了UAP56和URH49长度识别特异性
是什么原因导致了UAP56和URH49识别不同大小的circRNA分子？Hel25E介导circRNA出核的关键位点是哪里？作者首先在果蝇DL1细胞中构建各种Hel25E突变体，发现针对ATP结合结构域和解旋酶结构域的突变并不影响circRNA的出核。
由于Hel25E和UAP56都是调控大分子量circRNA的出核，而URH49调控小分子量的circRNA出核，那么会不会在三种蛋白的序列中存在Hel25E和UAP56相似而与URH49有一定差异的序列？经过比对分析发现位于蛋白序列中间的四个氨基酸序列符合这一规律（如下图所示）。这对这一段序列进行点突变，结果表明的确是由于这四个氨基酸的差异导致这类蛋白识别不同大小circRNA分子。
图5 四个氨基酸的差异导致了UAP56和URH49识别不同大小的circRNA （来自[1]）
本文的故事相对比较简单，但揭示了circRNA转录后输出细胞核的一个重要机制。当然从本文的结果来看，还有很多目前不能解释的现象，这也为后续探索circRNA出核及其他亚细胞定位问题提供了有价值的参考。
参考文献：
1. Huang, C., et al., A length-dependent evolutionarily conserved pathway controls nuclear export of circular RNAs. Genes Dev, 2018.