环状rna (circrna)是一类广泛表达的非共线rna (non-colinear RNAs, NCRs)，具有多种功能，包括作为miRNA的spongs，分离和转运蛋白质，调节转录和产生短蛋白等 (4-6)。Eric W Ottesen教授及其团队对生存运动神经元（Survival Motor Neuron ；SMN）基因产生的环状RNA进行检测分析，为更好地理解SMN基因功能提供了新的视角。
人类携带两个几乎相同的SMN基因拷贝：SMN1和SMN2。两种SMN基因通常含有9个带注释的外显子（外显子1,2A，2B，3,4,5,6,7和8），外显子7是最后的编码外显子。因此，外显子8，即最终注释的外显子，主要用作3’非翻译区。极少数情况下，来自反义AluY元件左臂的一部分内含子6被外显，产生了另一个称为6B的外显子。SMN1编码SMN，一种与RNA代谢相关的多功能蛋白，包括小核核糖核蛋白（snRNP）生物发生，转录，翻译和RNA运输。由于SMN2外显子7的主要跳跃导致编码了截短的蛋白质SMNΔ7 。由SMN1缺失或突变引起的低水平SMN导致脊髓性肌萎缩症（SMA），这是与婴儿死亡率相关的主要遗传疾病之一。
SMN产生多种具有5′-末端外显子的circRNA
作者根据掺入的外显子的性质将SMNcircRNA分为四种主要类型（图2A）。仅使用从外显子1到外显子4 的早期转录（5′-末端）SMN区域制备1型circRNA。将外显子5,6,6B和7视为中间外显子。使用至少一个中间外显子制备2型circRNA。将外显子8以及下游基因间外显子视为3’末端外显子。使用至少一个3′-末端外显子制备3型circRNA。SMN的 4型circRNA含有至少一个来自不同富含Alu的基因的外显子。
图1
图1：上图：SMN的基因布局显示。外显子被描绘为彩色形状，内含子被显示为线/虚线。外显子大小由外显子下面的黑色数字表示，内含子大小由内含子上方的灰色数字表示。外显子8中的新颖5′-ss 用黑色箭头标记。彩色箭头表示背刺事件，其厚度对应于每个事件的估计发生率。下图：通过规范的背刺事件产生的所有已识别的circRNA的概述。Type1：1型circRNA仅由外显子1至4产生; Type2：2型circRNAs包括一些早期外显子和一些中间外显子; Type3：3型circRNA包括含有外显子8A和/或下游序列的所有circRNA。Type4：4型circRNA通过反式剪接事件产生并包括非SMN序列。最丰富的circRNA以红色框出。
包含新的基因间外显子扩展了SMN circRNA 的多样性
研究结果显示28个含有3’末端外显子的circRNAs，其中22个属于3型类别（图2）。其余6个circRNA属于2型。其中15个circRNA掺入来自外显子8下游的基因间序列的四个新外显子中的一个或两个。在本研究中首次报道的新外显子，是由外显子8下游的基因间序列产生，作者将这些外显子命名为9,10,11和12。（图 2）。只有外显子9来自Alu元件。因此，外显子9成为外显子6B后的第二个SMN来自Alu元件的外显子。与映射到Alu元件的反义序列的左臂的外显子6B相反，外显子9映射到Alu元件的反义序列的右臂。外显子10和11分别来自DNA和LTR重复序列。作者分别检测到了携带外显子9 / 9tr1,10,11和12的9,7,3和1种circRNA，表明早期基因间外显子比后来的基因间外显子更容易地并入circRNA中。这可能是由于RNA pol II进入基因间区域时转录终止导致的。直到外显子12的基因间区域的转录不一定保证包含所有先前的基因间外显子。例如，携带外显子11和12的C7-8A-11-12缺乏基因间外显子9和10.此外，作者并没有检测到包含外显子10和11的任何circRNA，表明这两个基因间外显子可能存在互斥。
图2
图2：显示了SMN基因布局的3’部分的基因组概述。下图：通过规范的背刺事件产生的所有已识别的circRNA的概述。标签和颜色编码与图1中的相同。
SMN circRNA在人体组织中普遍表达
为了确定体内SMN circRNA 的表达，作者检查了10种人体组织，包括脑，脊髓，心脏，骨骼肌，平滑肌，肝，肾，肺，子宫和睾丸。结果表明C2B-3-4和C3-4是在所有检查组织中产生的最丰富的1型circRNA（图3，泳道21-40）。与用培养细胞获得的结果类似，C6-7-8A是在所有检查的组织中产生的最丰富的3型circRNA（图3，泳道51-60）。这些结果证实了外显子8内新颖5’ss的普遍使用以及截短的外显子8A掺入circRNA中。总之，作者的研究结果证实C2B-3-4，C3-4和C6-7-8A是普遍表达的，并构成SMN产生的最丰富的circRNA 。作者的结果还证实了几种低丰度circRNA的表达。
图3
图3：使用人组织衍生的RNA，溴化乙锭染色的不同RT-PCR的凝胶。带的身份在凝胶的右侧给出。组织类型在每个泳道的顶部给出 缩写：Br，脑; Sc，脊髓; Ht，心脏; Sk，骨骼肌; Sm，平滑肌; 吕，肝; Kd，肾; Ln，肺; Ut，子宫; Ts，睾丸。
DHX9的下调引发SMN前mRNA剪接和circRNA产生的扰动
DHX9是含有DEAH的RNA解旋酶家族的成员，它会特异性地破坏IAR相关的双链RNA结构。为了找到各种SMN外显子和IAR相关双链RNA结构的剪接/回复之间的潜在相关性，作者在siRNA介导的DHX9下调后监测线性和环状转录物的水平。同时，作者还在siRNA介导的DDX5和DDX17下调时监测线性和环状转录物的水平。值得注意的是，DDX5及其旁系同源DDX17是高度保守的DEAD盒解旋酶家族成员，已知通过结构重排调节转录pre-mRNA剪接和miRNA生物发生。作者通过蛋白质印迹确认在siRNA转染后96小时蛋白质仍下调然后进行了这些实验。作者每个基因使用两种不同的siRNA来确保结果不会被任何特定的siRNA序列所干扰。实际上，作者观察到针对作者检查的所有三种基因的两种siRNA的结果几乎相同。DDX5的下调导致DDX17的显着上调（图4A，泳道5和6）。然而，作者没有捕获DDX17下调时DDX5的对应上调（图4A，泳道7和8）。DHX9的下调对DDX5或DDX17的水平没有影响，反之亦然（图4A）。作者使用MESDA来捕获线性SMN通过选择性剪接产生的转录物的相对丰度（图4B）。DDX5和DDX17的下调对SMN外显子的可变剪接没有显示出明显的影响（图4B，泳道5-8）。然而，DHX9的下调显示出外显子3的跳跃事件增加，其中既有跳过了其他外显子的事件，也有不跳过其他外显子的事件（图4B，泳道3和4）。最不寻常的剪接变体是Δ3,4，Δ3-5，Δ3,4,7，Δ3-5,7，Δ5-7，Δ2B-5,7和Δ2A-5,7，表明DHX9下调引起SMN所有内部外显子的线性剪接变化。
图4
图4：（A）左图：Western印迹，表明有和没有siRNA转染的DHX9，DDX5和DDX17的水平。 α-微管蛋白，β-肌动蛋白和GAPDH用作上样对照。 样品处理显示在顶部。 使用的抗体显示在右侧，附近的分子量标记显示在左侧。 右图：Western印迹结果的定量。 对于每个条带，减去背景信号，然后通过β-肌动蛋白标准化信号。 使用靶向每个基因的两个独立siRNA（n = 4）对两个重复进行定量和统计分析。 误差棒表示平均值的标准误差（SEM）。 与未转染的和siRNA对照样品相比，* P <0.05，** P <0.01。 （B）MESDA描绘了线性SMN前mRNA的剪接模式。 处理类型显示在凝胶的顶部。 带标识标记在凝胶的右侧。 ‘Δ’表示具有跳过的外显子的SMN转录物。 （C）外显子/内含子组织和SMN1 / SMN2剪接的图解表示。 外显子被描绘为彩色框，内含子显示为线/虚线。 显示了转录起始位点（TSS），polyA（pA）和用于qPCR的引物的位置。
DHX9，DDX5和DDX17的下调对总SMN转录物的水平没有影响（图7C）。与MESDA的结果一致（图7B），qPCR的结果证实了具有DHX9下调的样品中Δ3-5转录物水平的显着增加，但是在DDX5或DDX17下调的样品中则没有（图7C））。有趣的是，DHX9下调导致含有SMN的新型基因间外显子的转录物水平增加（图7C）。这些结果与最近的发现一致，即DHX9下调导致poly（A）信号下游的通读（67）。
此外，研究还发现新型基因间外显子能被整合到SMN的线性转录物中，同时，与人类的SMN相比，小鼠Smn产生一组独特的circRNA，例如，与人类SMN产生的16种1型circRNA相比，作者观察到小鼠Smn利用规范剪接位点仅产生的5种1型circRNA 。同时发现了另外三种候选circRNA，mT1A，mT1D和mT1E，它们似乎使用不寻常的剪接位点进行成环等。结果表明，转录延伸抑制会影响SMN circRNA 的产生以及各种SMN环状rna的自我和交叉调节的生物发生，由于篇幅限制，无法详细说明。
参考文献
Eric W Ottesen,Diou Luo,Joonbae Seo,Natalia N Singh,Ravindra N Singh. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research, gkz034.