2020年7月2日，广东医科大学的熊兴东教授在Aging (Albany NY)（IF=4.831）杂志上发表了一篇题为“CircFOXO3 rs12196996, apolymorphism at the gene flanking intron, is associated with circFOXO3 levels and the risk of coronary artery disease”的文章，阐述circFOXO3基因侧翼内含子的rs12196996多态性与circFOXO3表达和冠状动脉疾病风险之间的相关性（[1]）。
circFOXO3在冠状动脉疾病（CAD）的发病过程中起着重要作用。 circRNA侧翼内含子的单核苷酸多态性（SNP）可能会改变其反向剪接并影响circRNA的生成。本篇文章中，作者旨在探索circFOXO3侧翼内含子的多态性对个体对CAD敏感性的影响。因此，作者进行一项病例对照研究。研究数据首次证明，在中国汉族人群中circFOXO3基因侧翼内含子的rs12196996多态性与CAD风险相关，这可能是通过影响circFOXO3的表达水平来实现的。
1 研究对象的特征
作者首先使用PS程序进行统计功效分析，以验证募集的样本是否可以提供足够的功效来鉴定多态性与CAD之间的联系。在总体参数设置下，奇数比的影响大小为1.36，等位基因频率为0.161，样本在I类错误率为0.05时可以提供82.3％的统计功效。功效分析表明样本量足以进行统计分析。
表1列出了CAD组和对照组的基本特征，在年龄方面，病例组和对照组之间没有显著的统计学差异。与对照组相比，CAD患者的男性、吸烟者和饮酒者的比例更高。此外，CAD组的空腹血糖、收缩压和舒张压的临床数据显着高于对照组。在脂质谱比较中，CAD患者的TG和LDL-C显着高于对照组，而血清HDL-C显着低于对照组。CAD患者比对照组更容易患糖尿病、高血压和血脂异常。总之，这些数据进一步表明，男性、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和高脂血症是中国汉族人群发生冠心病的重要危险因素。
表1 CAD组和对照组的样本特征
2 circFOXO3多态性与CAD风险的多变量关联
在575个CAD患者和610个对照样本中，对位于circFOXO3侧翼内含子中的两个tagSNP（rs12196996和rs9398171）进行基因分型。作者观察到，这些突变体的基因型频率在对照组之间处于Hardy-Weinberg平衡状态，没有提供数据集中人群分层的证据。表2总结了circFOXO3 tagSNP的多种遗传模型及其与CAD风险的关系。通过等位基因关联分析，作者发现只有rs12196996具有统计学意义，并且在调整常规风险因素后，G等位基因与CAD风险的显着增加相关（OR = 1.36，95％CI = 1.06-1.73，P = 0.014 ）。此外，与AA基因型相比，GG基因型也表现出CAD风险的增加（OR ＝ 2.36，95％CI ＝ 1.16-4.80，P ＝ 0.018）。作者在隐性模型中观察到相似的关联趋势，GG基因型与CAD风险增加相关（OR = 2.21，95％CI = 1.09-4.47，P = 0.027）。综上所述，作者的数据表明circFOXO3侧翼内含子的rs12196996多态性与CAD风险有关，并且携带G等位基因的个体可能对CAD的易感性明显增加。然而，在等位基因和已建立的遗传模型下，未观察到rs9398171与CAD风险之间的显着关联（表2）。心肌梗塞（MI）作为CAD的主要表型。作者还分析了这两个tagSNP与MI风险之间的关联，发现rs12196996和rs9398171均与MI风险无关。
表2 circFOXO3侧翼内含子中的tagSNP与CAD风险的多变量关联
3 circFOXO3 rs12196996和CAD风险的分层分析
作者进一步评估了按年龄、性别、吸烟和饮酒状况分层的等位基因和CAD易感性之间的联系（表3）。在携带G等位基因的年轻人群(≤60岁，OR=1.82，95%CI=1.19-2.76，P=0.005)和不吸烟人群(OR=1.37，95%CI=1.0 2-1.85，P=0.039)中，CAD风险的增加更为明显。在按性别或饮酒划分的亚组中，未观察到rs12196996等位基因与CAD风险之间的进一步明显联系。
表3 分层分析circFOXO3基因rs12196996多态性与冠心病风险的多变量关联
4 circFOXO3多态性与CAD风险的单倍型分析
作者使用Haploview平台对两个tagSNP进行连锁不平衡（LD）分析。如图1所示，两个tagSNP(rs12196996和rs9398171)处于连锁不平衡状态(D‘=0.99)，表明它们位于一个单倍型区块中。表4总结了两个tagSNP衍生的常见单倍型（频率> 3％）及其对CAD的风险预测。作者发现携带rs12196996 G等位基因的单倍型rs12196996G-rs9398171C与CAD风险增加相关（OR = 1.31，95％CI = 1.06-1.61，P = 0.013）。下一步进行分层分析，显示这种单倍型似乎增加了年轻受试者和非吸烟者的CAD风险（表4）。
图1 circFOXO3突变体之间的成对连锁不平衡分析
表4 circFOXO3侧翼内含子TagSNP与冠心病风险的单倍型分析
5 rs12196996与circFOXO3表达之间的关联
为了进一步研究circFOXO3 rs12196996多态性的功能相关性，作者利用实时定量RT-PCR技术对rs12196996基因型与circFOXO3和线性FOXO3的表达水平进行相关性分析。circFOXO3的PCR产物直接进行测序，证实了外显子3反向剪接的存在。如图2A所示，在携带GG基因型的受试者中，circFOXO3的表达水平比具有AA或AG基因型的受试者更低。从总体上看，与组合的AA + AG基因型相比，GG基因型与较低水平的circFOXO3之间存在显着关联（P = 0.040，图2B）。然而，rs12196996与线性FOXO3的表达水平之间并没有显着联系（图2C和2D）。
图2 CAD组和对照组外周血单个核细胞中circFOXO3或线性FOXO3表达水平与rs12196996之间的关联
参考文献[1]：Zhou YL, Wu WP, Cheng J, et al. CircFOXO3 rs12196996, a polymorphism at the gene flanking intron, is associated with circFOXO3 levels and the risk of coronary artery disease [published online ahead of print, 2020 Jul 2]. Aging (Albany NY). 2020;12:10.18632/aging.103398. doi:10.18632/aging.103398