2020年8月4日，著名肝脏学杂志Hepatology在线发表了哈尔滨医科大学附属第二医院崔云甫团队的一项circRNA研究工作，报道胆管癌中ERBB2来源circRNA（文中命名为circ-CCAC1）在胆管癌中具有促癌作用，circ-CCAC1可以通过胞外囊泡进入内皮细胞并导致内皮细胞屏障的破损，进而促进肿瘤侵袭转移和血管生成（[1]）。
作者首先在胆管癌患者胆汁中的细胞外囊泡（EVs）及胆管癌组织中，circ-CCAC1的表达水平增高，进一步，基于临床标本分析评估，circ-CCAC1具有胆管癌诊断和预后评估价值。在胆管癌中，circ-CCAC1通过竞争性结合miR-514a-5p上调YY1， YY1通过直接与CAMLG的启动子结合促进其转录。此外，作者还发现胆管癌患者癌组织来源的细胞外囊泡中也可以携带circ-CCAC1并转移至内皮单层细胞中，破坏内皮屏障的完整性并进一步诱导血管生成。机制上，circ-CCAC1可以 通过促进EZH2滞留在细胞质中，提高SH3GL2的表达，降低细胞间连接蛋白的表达水平，进而导致内皮屏障的破坏。体内模型进一步证明，细胞中和胞外囊泡中的circ-CCAC1表达升高有助于胆管癌的肿瘤进程和转移侵袭。这项研究工作增进了胆管癌中circRNA在肿瘤发生发展和转移侵袭方面的认知，也发现了circ-CCAC1作为胆管癌诊断和预后评估标志物的价值（[1]）。文中报道的circ-CCAC1作用机制也进一步证明了circRNA在疾病发生发展中的作用和机理的复杂多样。下面我们就详细学习一下本文的主要内容：
如何发现circ-CCAC1的？
为探索胆管癌中circRNA的表达和功能，作者首先通过芯片法分析了胆管癌患者胆汁细胞外囊泡中circRNA的表达情况。从约50mL的胆汁样品中分离了100uL的胞外囊泡样品，囊泡密度在2.9–3.1 × 1011 EVs/mL，进行了粒径和外泌体标志物检测（Alix，CD63，TSG101）。芯片法分析了5例胆管癌患者胞外囊泡样品和5例对照样品的circRNA。与此同时，作者还将5例对应胆管癌患者的癌组织与癌旁组织进行了高通量RNA-seq测序分析。胞外囊泡的芯片分析共发现了85种差异circRNA分子，癌与癌旁组织的高通量测序分析发现了140种显著差异的circRNA分子。两种分析的结果中发现了3个circRNA变化趋势一致，进一步的QPCR分析表明，hsa_circRNA_102064的差异最显著。hsa_circRNA_102064由ERBB2的23-26外显子形成。早期研究中曾将ERBB2基因外显子3-7形成的circRNA命名为circ-ERBB2，为有效区分，本文中将hsa_circRNA_102064命名为circ-CCAC1。
QPCR结果表明，circ-CCAC1在胆管癌患者的胆汁和血清胞外囊泡中的表达显著升高，预示该分子可能具有作为标志物分子的潜力。ROC分析和生存分析表明circ-CCAC1可以作为胆管癌诊断和预后的标志物。QPCR检测也表明circ-CCAC1在胆管癌细胞系和胞外囊泡中显著升高。
图1 胆管癌胞外囊泡和癌组织中circ-CCAC1表达升高 （[1]）
体外circ-CCAC1促进胆管癌细胞增殖
为了分析circ-CCAC1的功能，作者设计了靶向circ-CCAC1的shRNA，验证实验表明在CCLP1和QBC939细胞中干扰效率可达70-80%，母基因ERBB2未受影响。细胞增殖检测表明干扰circ-CCAC1后增殖速率下降。Ki-67免疫荧光检测显示干扰circ-CCAC1后信号显著减弱，说明细胞增殖受到了明显抑制。克隆形成，划痕实验，Transwell分析表明干扰circ-CCAC1后细胞的转移侵袭能力受到抑制。
图2 干扰circ-CCAC1抑制胆管癌细胞增殖和迁移侵袭 （[1]）
circ-CCAC1竞争性结合miR-514a-5p
FISH检测表明circ-CCAC1位于细胞质中。两种细胞分别通过敲低circ-CCAC1后进行高通量RNA-seq测序，分析差异表达基因。在两种细胞的差异基因中，共同发现了YY1基因在敲低circ-CCAC1后表达显著下降。利用Starbase 2.0 和circBank数据库进行检索分析，分别检索到14种和58中结合的miRNA分子，其中有5种miRNA分子是重合的，分别是miR-182-5p，miR-514a-5p，miR-1343-3p，miR-3619-5p和miR-6746-5p。anti-AGO2 RIP实验表明circ-CCAC1可以结合在AGO2上。RNA pull-down实验证明在两种细胞中均能显著富集miR-514a-5p，其他几种miRNA分子没有富集。荧光素酶报告基因实验也证明了miR-514a-5p与circ-CCAC1及YY1基因3’-UTR的相互作用。
图3 circ-CCAC1竞争性结合miR-514a-5p （[1]）
胆管癌中YY1调控CAMLG表达
YY1是一种转录因子，为找到胆管癌中YY1作用的靶基因，作者进行了ChIP-seq分析。从Peak Score＞1000和Motif Score＞15的富集结果中共得到6个基因同时满足两种条件，分别是PCIF1，GLTSCR2，UBA52，TAF5，MORF4L1和CAMLG。两种胆管癌细胞中过表达YY1，QPCR检测结果显示仅有CAMLG基因的表达显著升高，其余5种基因没有明显变化，同时干扰内源YY1后也只有CAMLG的表达受到明显抑制。TCGA数据表明胆管癌中CAMLG表达上调，与YY1的表达呈现正相关。Western检测，ChIP-QPCR检测和荧光素酶报告基因检测进一步验证了YY1可以调控CAMLG的表达。
图4 胆管癌中YY1调控CAMLG表达 （[1]）
胆管癌细胞胞外囊泡携带circ-CCAC1选择性进入血管内皮细胞
通过差速离心法分离胆管癌细胞培养上清的胞外囊泡，Dil标记后添加到Huh-28和HUVEC细胞培养基中，24小时后可见被标记的胞外囊泡可进入这些细胞内。分别用非癌对照续保HIBEC和CCLP1的胞外囊泡添加到Huh-28和HUVEC细胞培养基中，QPCR检测circ-CCAC1的表达，结果显示只有HUVEC细胞添加了CCLP1细胞来源的胞外囊泡才可增加靶细胞中circ-CCAC1的表达，Huh-28细胞没有出现circ-CCAC1的表达升高，表明胞外囊泡携带circ-CCAC1可选择性的进入HUVEC细胞。CCLP1细胞中过表达或敲低circ-CCAC1后分离的胞外囊泡也可对应的升高或降低HUVEC细胞中circ-CCAC1的表达。罗丹明渗透速率分析和Huh-28跨内皮侵袭分析表明，CCLP1细胞来源胞外囊泡能增加HUVEC单层细胞的通透性，CCLP1中过表达和干扰circ-CCAC1后的胞外囊泡可相应增加和降低通透性。Tube Formation分析也表明CCLP1细胞来源胞外囊泡能增加HUVEC的Tube Formation能力，CCLP1中过表达和干扰circ-CCAC1后的胞外囊泡可相应增加和降低Tube Formation。
图5 CCLP1细胞胞外囊泡携带circ-CCAC1选择性进入HUVEC细胞 （[1]）
内皮细胞中circ-CCAC1阻碍EZH2定位，调控SH3GL2/ZO-1/Occludin通路
ZO-1/Occludin是内皮细胞紧密连接结构的重要组分，作者首先分析了CCLP1细胞胞外囊泡处理后HUVEC细胞中ZO-1/Occludin的表达情况，结果表明，CCLP1细胞来源胞外囊泡能显著下调HUVEC中ZO-1/Occludin的表达，CCLP1中过表达circ-CCAC1后的胞外囊泡可更显著的下调ZO-1/Occludin的表达，CCLP1中干扰circ-CCAC1不再有相应的变化。有趣的是，在内皮细胞中干扰circ-CCAC1并不能影响YY1和CAMLG的表达。RPISeq数据库预测可能与circ-CCAC1相互作用的蛋白，预测结果表明EZH2，DNMT1和STAU1可能与circ-CCAC1存在相互作用。RIP和RNA pull-down实验验证后表明，EZH2与circ-CCAC1存在明显的相互作用。FISH共定位分析结果也验证了这一相互作用。增加胞外囊泡的circ-CCAC1量可显著增加EZH2的胞质定位水平，与此同时降低ZO-1和Occludin的表达。SH3GL2是ZO-1/Occludin的负调控因子，胞外囊泡中的circ-CCAC1可增加SH3GL2的表达。ChIP实验表明EZH2可直接结合到SH3GL2的启动子，促进其H3K27me3甲基化水平，由此抑制SH3GL2的表达。胞外囊泡来源的circ-CCAC1能降低EZH2结合到SH3GL2启动子的效率，进而促进SH3GL2的表达，SH3GL2进一步抑制了ZO-1/Occludin的表达。
图6 内皮细胞中circ-CCAC1限制EZH2入核，调控SH3GL2表达 （[1]）
体内模型分析circ-CCAC1功能
最后，作者利用多种体内模型分析了胆管癌细胞和胞外囊泡circ-CCAC1对肿瘤生长和转移的作用，包括肿瘤大小，重量，肺转移和肝转移的检测。结果表明，CCLP1细胞干扰circ-CCAC1后可降低肿瘤生长速度，而如果同步注射由稳定过表达circ-CCAC1的CCLP1细胞收取的胞外囊泡，则能恢复肿瘤生长的速度。肺转移和肝转移的检测表明胞外囊泡中增加circ-CCAC1能促进转移效率。
图7 体内模型分析circ-CCAC1功能 （[1]）
胆管癌中circ-CCAC1作用机制汇总
胆管癌细胞中ERBB2来源的circ-CCAC1表达升高，在癌细胞中通过竞争性结合miR-514a-5p促进YY1的升高并进一步促进CAMLG的表达。circ-CCAC1还可以通过进入外泌体的方式远程影响内皮细胞。内皮细胞接收胆管癌细胞释放的携带circ-CCAC1的胞外囊泡（可能主要是外泌体，两者略有区别），获得circ-CCAC1分子。circ-CCAC1在内皮细胞中可结合EZH2并阻止其进入细胞核，由此导致由EZH2介导的SG3GL2启动子区H3K27me3修饰减弱，SG3GL2启动子被激活并导致SG3GL2基因表达上调。SG3GL2是ZO-1/Occludin表达的抑制因子，SG3GL2的升高导致ZO-1/Occludin的表达下降，内皮细胞的紧密连接减弱，通透性增加，进而促进了肿瘤细胞的浸润和迁移。
图8胆管癌中circ-CCAC1机制和功能汇总 （[1]）
本文主要思路概括
通读全文的过程中有些收获借此机会跟大家一起分享一下，有不恰当的地方欢迎批评指正。本文的工作非常细致严谨，也对circRNA作用机制进行了新的探索并发现了一些有趣的现象，这项工作的一些思路和技术值得circRNA研究同行借鉴学习：
图9 本文的主要技术路线与方法
参考文献：
1. Xu, Y., et al., A novel circular RNA, circ-CCAC1, contributes to CCA progression, induces angiogenesis, and disrupts vascular endothelial barriers. Hepatology, 2020.