敲除模型一直以来都是circRNA研究的一个拦路虎，至今已报道的成功构建的circRNA敲除模型寥寥无几。比较典型的如中科院生物物理所范祖森团队报道的小鼠体内敲除cia-cGAS和circPan3的研究工作。8月14日，中科院生物物理所范祖森和田勇团队再次发表circRNA敲除模型的新报道，报道小鼠中敲除circKcnt2可导致ILC3细胞的活化并导致严重的结肠炎（[1]）。
重大进展：环形RNA参与造血干细胞静息状态调控
3型先天性淋巴样细胞（ILC3）参与调控肠道免疫，炎症和肠组织稳态，但ILC3活化的机制目前所知还比较有限。本文中，作者发现circKcnt2在诱导肠道炎症模型中表达增高。敲除circKcnt2会导致小鼠肠道ILC3活化和严重结肠炎。机制方面，circKcnt2主要定位于细胞核，结合并募集NuRD至Batf基因启动子，抑制Batf表达，进而抑制IL17的表达，阻止ILC3的失活，从而促进结肠炎的消退。此外，Mbd3-/- Rag1-/-和circKcnt2-/- Rag1-/-小鼠在DSS处理后发展为严重的结肠炎。如果同时敲除Batf则能促进结肠炎的消退。本文基于敲除模型印证了circRNA在生理病理活动中的重要作用。下面我们就如何找到这个circRNA，如何验证该circRNA的功能，如何探讨其作用机制等方面详细学习本文的内容：
如何发现circKcnt2与ILC3活化的关系的？
发现并证明circKcnt2与ILC3活化的关系是本文的基础，作者如何找到这个circRNA的？作者首先通过分离Rag1-/-敲除小鼠DSS处理前后的ILC3细胞，芯片法分析了这两组细胞中差异表达的circRNA分子，挑选DSS处理组升高最显著的前10个circRNA进行QPCR验证，结果表明这些circRNA均有显著升高。为进一步确认与ILC3活化有关的circRNA分子，作者首先用shRNA对这些circRNA进行敲低，然后用稳定敲低的ILC3细胞重新注射回Rag1-/- IL2rg-/-敲除小鼠中，然后用DSS处理。结果显示circKcnt2的效应最明显。Northern，RNase R实验均验证了circKcnt2为环状RNA分子。DSS处理时间梯度数据显示在6天后ILC3细胞中circKcnt2表达值达到最大。FISH实验结果显示circKcnt2主要定位于细胞核中。
图1 circKcnt2的发现和验证 （[1]）
如何证明circKcnt2与ILC3活化的关系的？
为分析circKcnt2在体内的生理功能，作者构建了circKcnt2敲除的小鼠模型。敲除位点为侧翼内含子中介导成环的反向互补序列，经过mini基因的验证后确认。所选择的互补序列不仅具有序列上的互补，还在进化上有一定的保守性。敲除模型中circKcnt2表达，母基因Kcnt2的表达均做了分析，可以证明实现了特异性敲除circKcnt2，而母基因没有受到影响。
杂交获得circKcnt2-/- Rag1-/-双敲除模型，DSS处理构建肠炎模型。相比于单敲Rag1-/-小鼠，双敲小鼠的IL17a表达显著升高，IL17阳性的ILC3细胞比例显著升高。在敲除模型中重新过表达circKcnt2则可抵消敲除circKcnt2后的表型。说明所观察的现象是由于敲除circKcnt2导致的。
此外，circKcnt2-/- Rag1-/-双敲除小鼠相对于Rag1-/-单敲模型在DSS处理后体重下降更明显，结肠损伤和淋巴细胞浸润程度也更严重。双敲小鼠的结肠炎评分也更高，存活率也明显下降。circKcnt2-/- Rag1-/-双敲除小鼠 IL17+的ILC3细胞显著增高，时间梯度实验结果表明在第九天达到最高值。向Rag1−/−Il2rg−/−小鼠中分别移植circKcnt2-/- Rag1-/-双敲或Rag1-/-单敲小鼠来源的ILC3细胞，结果表明双敲小鼠细胞移植后表现出更严重的结肠损伤和淋巴细胞浸润，结肠炎评分更高，体重下降更显著。
图2 circKcnt2敲除小鼠表型分析 （[1]）
如何分析circKcnt2的功能机制？
芯片法分析circKcnt2野生型和敲除小鼠ILC3细胞的转录组，发现敲除circKcnt2后导致了一些转录因子表达的升高，其中Batf变化最显著。CHIRP实验结果显示circKcnt2可以结合Batf基因启动子区的-1800 ~ -1600的区域。杂交实验也证明这一段DNA与circKcnt2的相互作用。荧光素酶实验也证明了这个相互作用。序列分析表明circKcnt2有5个颈环结构，依次突变后与DNA探针杂交分析，结果表明第四颈环与该相互作用有关。序列分析找出可能互补结合的位点，突变后杂交分析，证明了相互作用位点。ChIP实验显示，敲除circKcnt2后Batf启动子的H3K27ac信号增强，H3K27me3下降。DNase I分析也表明敲除circKcnt2后Batf启动子的核小体密度降低，DNase I可接近性更强。Nuclear Run-on实验也支持这一现象。结合位点突变型circKcnt2构建敲入模型。circKcnt2 mut模型可抑制circKcnt2结合到Batf启动子。与circKcnt2 WT Rag1−/−小鼠相比，circKcnt2 mut Rag1−/−在DSS处理后原发性结肠炎程度更严重。
图3 circKcnt2结合Batf启动子发挥作用 （[1]）
为找到circKcnt2调控Batf表达的机制，作者通过RNA pull-down进行了互作蛋白的钓取和分析。线性化circKcnt2用生物素标记，然后银染，找到了差异条带，质谱鉴定后发现Mbd3。Mbd3是NuRD复合体的组分，进一步RNA pull-down后WB检测，能捕获到NuRD复合体的大部分组分。EMSA进一步证明，只有Mbd3可以直接与circKcnt2相互作用。FISH，RIP实验进一步验证了这一相互作用关系。circKcnt2的5个颈环结构分别突变实验表明，第五号颈环结构是NuRD相互作用的位点。
图4 circKcnt2与Mbd3相互作用 （[1]）
前面提到作者已经发现circKcnt2可以结合Batf启动子-1800~-1600的位置，Mbd3是否也是在这个位置结合的？为此，作者进行了anti-Mbd3的ChIP分析，结果证明Mbd3的确是在这个位置结合的，NuRD复合物的其他组分也是在该位置结合Batf的启动子，circKcnt2敲除后NuRD与该位点的结合消失，但Batf启动子结合位点突变的circKcnt2 敲入小鼠细胞中，NuRD复合物依然能结合到Batf启动子位点。免疫荧光检测证明了circKcnt2，Mbd3，Batf启动子的共定位关系。交联实验也表明NuRD复合物与circKcnt2是同步洗脱的，但在circKcnt2敲除细胞中NuRD洗脱峰前移。ChIRP实验证明野生型circKcnt2与NuRD复合体能同步洗脱，但Batf启动子结合位点突变的circKcnt2细胞中，NuRD不再与Batf启动子共洗脱。Mbd3-/- 敲除小鼠与circKcnt2-/-敲除小鼠杂交，获得双敲模型。H3K27ac ChIP分析表明，Mbd3-/- 敲除小鼠Batf启动子区富集显著升高，而Mbd3-/- circKcnt2-/-双敲小鼠信号更加明显。DNase I实验，Nuclear Run-on分析均表明circKcnt2敲除后能促进Batf启动子区的开放。QPCR和WB检测Batf基因表达也证明了上述现象。
图5 circKcnt2募集NuRD复合体至Batf启动子 （[1]）
上述研究结果充分证明了circKcnt2调控Batf基因表达的机制，那么Batf是否是circKcnt2介导的ILC3活化和肠炎表型的关键因子呢？作者构建了Batf的敲除小鼠模型，然后通过与Rag-/-小鼠杂交，获得了Batf-/- Rag-/- 双敲除小鼠模型。DSS处理实验表明，双敲除小鼠IL-17阳性的ILC3细胞显著降低，IL17的分泌量也显著下降。Anti-Batf ChIP实验证明Batf可以结合到IL17a的启动子，FISH和免疫荧光实验和EMSA实验也证明了这一共定位关系。荧光素酶实验证明敲除Batf后IL17a表达显著下降。Nuclear Run-on分析，QPCR均表明敲除Batf可显著降低IL17a的表达。小鼠模型中DSS处理实验表明敲除Batf可减缓肠炎导致的体重下降及炎症程度。这些实验充分说明Batf在DSS处理后的肠炎表型中起关键作用。
图6 Batf介导的ILC3活化和肠炎表型 （[1]）
上述实验结果还是不能完全证明circKcnt2可以通过NuRD复合体调控Batf表达，进而介导ILC3细胞活化与肠炎表型的关系，Mbd3在这一过程中的作用还需要进一步证明。作者通过杂交获得Mbd3-/- Rag-/-双敲模型，分析IL-17a的表达，结果显示，敲除Mbd3与敲除circKcnt2有相似的效应。DSS处理后分析不同基因型的小鼠ILC3细胞数目，发现敲除circKcnt2的IL-17+ ILC3细胞显著上升，而在circKcnt2-/-Batf-/-Rag1-/- 三敲除小鼠 (TKO)中IL-17+ ILC3细胞不再增加。体重，炎症评分进一步证明了敲除circKcnt2和Mbd3均可显著降低体重，增加炎症评分，而三敲除小鼠中该变化明显减弱。在三敲除基础上进一步增加Mbd3敲除的基因型的四敲除模型（DKO，Mbd3-/-circKcnt2-/-Batf-/-Rag1-/-），分离DKO和野生型小鼠ILC3细胞，移植到Rag1-/-Il2rg-/-小鼠，DSS处理，抗IL-17抗体处理。结果显示Mbd3-/-和circKcnt2-/敲除后的ILC3可导致更严重的结肠炎表型，而四敲除小鼠的细胞这种表型消失。抗IL-17抗体处理后，各种基因型小鼠的肠炎表型均消失，说明IL-17在这一肠炎模型中发挥关键作用。
图7 Mbd3敲除模型与其他基因型模型中肠炎表型分析 （[1]）
本文的思路整理：
本文用到了多种基因敲除小鼠模型，也用到了circRNA突变体的敲入模型，是circRNA转基因小鼠模型研究的代表性成果，有重要的参考意义。本文的主要研究思路和技术方法汇总如下：
图8 本文的主要科学问题及研究思路整理
参考文献
1. Liu, B., et al., An inducible circular RNA circKcnt2 inhibits ILC3 activation to facilitate colitis resolution. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 4076.