2020年9月14日，中山大学孙逸仙纪念医院苏士成、许小丁和中山大学附属第三医院高志良作为共同通讯作者，在国际顶级杂志Cell在线发表了一项circRNA的重大研究成果。
免疫代谢类疾病已成为重大的公共健康问题，与高能量摄入和久坐有关，常带有炎症特征，包括非酒精性脂质性肝炎（NASH），糖尿病，肥胖等等。代谢紊乱如何导致不可控制的炎症状态的机制目前还没有很好的解决。在脂质暴露的肝脏成纤维细胞中，作者发现了线粒体来源的ROS与促炎症表型有关。结合芯片分析的circRNA表达谱，发现了三个线粒体来源的在NASH中显著下调的circRNA分子。作者利用开发的靶向线粒体的mito-NP递送系统，过表达三个circRNA看对ROS生成和胞质/线粒体ROS量的影响情况，最终确定hsa_circ_0089762与NASH中线粒体ROS释放有关，基于后期的研究结果，作者将该circRNA命名为SCAR。SCAR直接与ATP5B相互作用，阻止ATP5B与CypD的结合并抑制mPTP的开放，进而抑制线粒体ROS的释放。利用线粒体靶向递送系统表达SCAR能抑制NASH的促炎症表型。动物模型和临床标本实验进一步验证了这些现象和机制（[1]）。下面我们就一起学习一下本文的主要内容：
1、线粒体ROS介导脂质暴露后成纤维细胞的促炎症表型
作者分离NASH和对照患者肝脏成纤维细胞，SeaHorse检测代谢指标OCR和ECAR，结果显示NASH患者肝脏成纤维细胞OCR和ECAR均升高，并且ECAR/OCR的比值在NASH患者中也升高。Palmitate处理正常成纤维细胞也有相似的变化情况。这说明脂质暴露可诱导成纤维细胞ATP生成方式从线粒体TCA循环和氧化磷酸化为主转变为胞质糖酵解为主。JC-1检测线粒体跨膜电势结果显示，NASH肝脏成纤维细胞中跨膜电势显著降低。透射电镜结果表明NASH肝脏成纤维细胞线粒体呈现肿胀状态（Swell）。线粒体在应激状态往往会表现出ROS增高的情况，为检测出ROS在胞质（cROS）和线粒体（mROS）中的含量，作者选择了两种检测的技术方法：一种是荧光探针法，mitoSOX可特异性显示线粒体中ROS的含量，DCFH-DA可特异性检测胞质中ROS的含量；另一种是转染不同定位的ORP蛋白，ORP蛋白是一种ROS敏感的蛋白，可以通过测定405/488 nm 荧光比值测定ROS含量，分别将特殊定位信号融合可介导胞质（cytoORP）和线粒体（mitoORP）定位。两种方法均显示，NASH肝脏成纤维细胞cROS和mROS均升高。Palmitate处理正常成纤维细胞也有相同的变化。已知线粒体中ROS可以通过mPTP通道渗透至胞质中，这可能也是胞质ROS的主要来源。mPTP抑制剂cyclosporine A处理后在NASH肝脏成纤维细胞和Palmitate处理正常成纤维细胞中cROS均降低，说明上面检测到的ROS升高主要是线粒体来源的mROS生成增高所致，mPTP孔的开放促进了cROS的增高。ROS介导了很多的免疫细胞活化，但在成纤维细胞活化过程中的作用还没有相关的研究。ROS抑制剂（mitoTEMPO和DPI）可抑制NASH肝脏成纤维细胞收缩性，抑制I型和III型胶原及α-SMA的表达，一些炎症相关因子表达也显著下降，包括IL-1β，IL-8，TNF-α，CCL-2。这些数据说明mROS介导了成纤维细胞脂质暴露后的一些促炎症表型。
图1 mROS与NASH肝脏成纤维细胞促炎症表型 （[1]）
2、脂质暴露改变线粒体circRNA表达谱
成纤维细胞中circRNA的认识还非常有限，为了进一步探索上面发现的这些现象，作者收集了NASH和健康对照的肝脏成纤维细胞各4例，进行circRNA的芯片检测。NASH组显著下调的circRNA分子中线粒体DNA来源的circRNA比较靠前，一共分析到了4个线粒体DNA表达的circRNA，其中有三个是表达下调显著的。分离胞质和线粒体组分的实验也验证了这三个circRNA的定位，均为线粒体定位。
图2 NASH肝脏成纤维细胞线粒体circRNA表达下调 （[1]）
3、hsa_circ_0089762（SCAR）显著降低NASH肝脏成纤维细胞cROS
细胞中线粒体靶向递送是非常有挑战的技术难题，作者设计了一种特殊的pH敏感的线粒体靶向递送纳米颗粒（mito-PN），该系统可以实现特异性的将circRNA过表达载体输送至线粒体中。mito-PN颗粒被细胞内吞后进入内含体，其中的酸性环境导致mito-PN外层的包裹物质子化和解离，释放内层的线粒体靶向多肽TACP，最终实现将所包裹的质粒输送至线粒体中。为验证mito-PN靶向线粒体递送的效率，作者用lipo-3000作为对照，比较输送GFP表达载体在线粒体中靶向递送的效率。3D成像的数据显示，lipo-3000仅有12%左右的GFP信号与线粒体是共定位的，而mito-PN的线粒体定位效率可达90%。利用这一递送体系，作者发现过表达hsa_circ_0089762可显著降低NASH肝脏成纤维细胞cROS的升高，另外两个circRNA的一个不能通过mito-PN表达和递送（分子太大），另一个没有明显的效应。后面作者就将hsa_circ_0089762作为研究的目标分子，并根据其作用机制将其命名为SCAR（steatohepatitis-associated circRNA ATP5B regulator）。
图3 SCAR抑制NASH肝脏成纤维细胞cROS（[1]）
4、SCAR定位于线粒体，抑制成纤维细胞活化
FISH检测表明90%的SCAR信号均定位于线粒体，反向引物，RNase R分析，Northern检测鉴定了SCAR的circRNA特性。利用mito-PN系统在NASH肝脏成纤维细胞中过表达SCAR后线粒体膜电势恢复，Palmitate处理正常成纤维细胞也有同样的变化结果。Palmitate处理正常成纤维细胞中过表达SCAR后cROS和mROS均下降。NASH肝脏成纤维细胞中过表达SCAR可有效抑制细胞收缩性，I型和III型胶原及α-SMA的表达，抑制促炎症相关因子的表达，这些表型与ROS抑制的效应相似。
图4 SCAR定位于线粒体，抑制成纤维细胞的活化（[1]）
5、SCAR与ATP5B相互作用
为进一步分析SCAR的作用机制，作者分别分析了SCAR的ORF和miRNA的结合情况。预测的ORF中在终止密码子前添加3× Flag标签，如果该ORF可被翻译，可以通过WB检测相应的条带，作者在该体系中没有检测到相关的条带，因此没有进行翻译产物的分析。同样的，作者也预测了可能的miRNA结合位点，但没有一种miRNA的结合位点超过两个，并且这些miRNA都不是线粒体表达的，因此作者也没有从miRNA Sponge的角度进行分析。最终，作者通过RNA pull-down捕获了与SCAR的相互作用蛋白，质谱鉴定后发现了ATP5A和ATP5B均可以被捕获。细胞内ATP5A和ATP5B是直接相互作用的，SCAR是否同时与两者相互作用，还是仅与其中一个相互作用？体外纯化两种蛋白后EMSA分析实验表明，SCAR主要与ATP5B相互作用。不同线粒体定位的APEX标记体系显示，SCAR与ATP5B主要在线粒体基质中相互作用。序列分析表明，SCAR的100-182有颈环结构，删除突变实验表明SCAR主要通过这一段与ATP5B相互作用。之前的一项蛋白质谱研究数据显示ATP5B中的一段肽序列可能是与SCAR相互作用的位置，突变实验证明了这一段肽段与SCAR的相互作用有关。
图5 SCAR与ATP5B相互作用（[1]）
6、SCAR结合ATP5B阻断与CypD的相互作用，抑制成纤维细胞活化
mPTP通道的开放与线粒体膜电势降低和ROS升高有关，ATP5B是一种mPTP通道的调节蛋白，因此作者进一步探索了SCAR与mPTP通道的关系。Calcein释放分析可检测mPTP通道的开放，分析显示Palmitate处理正常成纤维细胞可显著释放calcein，而过表达SCAR后该效应消失，单过表达ATP5B结合位点的SCAR没有这种效应。CypD可以通过结合APT5亚基调控mPTP通道的开放，是否SCAR是通过影响CypD与ATP5B的相互作用而影响了这一过程？分别过表达SCAR野生型和突变型后Palmitate处理，CoIP分析CypD与ATP5B的相互作用情况，结果显示，过表达野生型SCAR能显著抑制两者的相互作用，而过表达突变型的SCAR没有这种效应。JC-1检测跨膜电势，cROS检测及细胞收缩性，I型和III型胶原及α-SMA的表达，抑制促炎症相关因子的表达检测结果表明，SCAR与ATP5B的相互作用阻止了CypD与ATP5B的相互作用，进而抑制了mPTP的开放，并进一步抑制了成纤维细胞活化的作用。
图6 SCAR结合并抑制CypD与ATP5B相互作用，抑制成纤维细胞活化 （[1]）
7、脂质暴露诱发ER Stress，通过CHOP抑制PGC1α和SCAR表达
SCAR由线粒体的轻链表达，它的来源基因是JA760600，已知一些核基因组编码的剪切相关的因子能进入线粒体并介导RNA的剪切，包括eIFA3，7种hnRNP蛋白。siRNA分析表明hnRNPM介导了SCAR的生成，其他蛋白的siRNA没有明显的效应。CLIP实验数据也证明了hnRNPM在SCAR侧翼的结合位点。RNase L可介导circRNA的降解，干扰RNase L后能显著抑制SCAR的降解。脂质暴露可导致成纤维细胞中SCAR的表达，为分析介导这一过程的因子，作者首先分析了SCAR和来源基因JA760600的转录因子位点，发现在上游-25~-18的位置有PGC1α的结合位点，ChIP实验验证了结合位点，Palmitate处理后PGC1α结合下降，干扰PGC1α也可抑制SCAR的表达。脂质暴露可诱导ER stress，进而诱导CHOP抑制PGC1α的表达。作者在 NASH肝脏成纤维细胞中检测了这些标志基因，Palmitate处理后干扰CHOP可恢复PGC1α的表达，并进而恢复SCAR的表达水平。这些数据表明，SCAR受到PGC1α的调控，脂质暴露后诱发ER stress，进而诱导CHOP上调，抑制PGC1α，进而导致SCAR的表达下调。
图7 脂质暴露诱发ER Stress，通过CHOP抑制PGC1α和SCAR表达（[1]）
8、SCAR缓解高脂饮食诱导小鼠肝硬化
小鼠中没有SCAR的同源产物，但小鼠的Atp5b与人的ATP5B高度同源，预实验表明SCAR可以与小鼠Atp5b相互作用。预实验也表明mito-PN可以在小鼠肝脏中实现有效的线粒体递送。因此可以借助该递送系统探索小鼠中过表达SCAR的效果。结果显示，过表达SCAR能够显著缓解高脂饮食诱导的肝硬化表型。
图8 小鼠中过表达SCAR抑制高脂饮食诱导的肝硬化（[1]）
9、临床标本中SCAR与肝脏脂肪变性到NASH的转变过程相关
为分析SCAR在临床标本中的表达与临床表型的关系，作者利用FISH检测分析了SCAR在NAFLD标本中的表达情况，结果显示，SCAR的表达状态与肝硬化评分和DHE阳性肝成纤维细胞比例显著负相关，健康肝组织，轻度肝脏脂肪变性，NASH轻度纤维化和NASH肝硬化的标本中SCAR的表达依次递减。这些数据表明SCAR的表达状态与NASH病变过程高度相关。
图9 临床标本SCAR表达与NASH疾病进程显著负相关（[1]）
本文从发现SCAR在NASH中表达下调，依次分析了SCAR的作用机制，生成机制，直到小鼠模型和临床标本验证，系统揭示了SCAR在NASH中的表达状态和功能机制。SCAR是线粒体来源的circRNA，作者开发的mito-PN体系有效的解决了线粒体中特异性递送和表达外源circRNA的技术问题，为线粒体来源circRNA的功能研究提供了借鉴，也再次证明circRNA是一类功能强大的分子，未来依然有很多值得探索的科学和临床问题。
参考文献
1. Zhao et al., Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output, Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009