结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤和第四大常见致死癌症。随着早期诊断和治疗的发展，结直肠癌的生产率在过去几年有所增加。尽管如此，肿瘤转移仍是阻碍治疗的主要因素。因此，研究结直肠癌转移的分子机制至关重要。
环状RNA的特征在于背面拼接的环状结构，其广泛存在于真核生物。越来越多的证据表明，环状RNA参与多种癌症转移。在结构上，环状RNA比其他RNA更稳定；功能上，环状RNA是miRNA反应元件。作者的研究旨在探索差异表达的环状RNA在结直肠癌发展中的作用。
研究思路
研究流程
1. Circ-GLIS2的筛选与验证
为了筛选新的环状RNA，作者首先将临床上的三对人类结直肠癌临床样品和邻近的正常组织进行circRNA微阵列分析，筛选出305个差异变化环状RNA（图1A，在结直肠癌中135个上调，170个下调）。为了减少范围，作者选择出结直肠癌中前20个差异表达的circRNA（图1B）。作者通过查阅文献发现其中一个上调环状RNA —-circGLIS2尚未在癌症中进行研究，于是确定了目标环状RNA circGLIS2。为了验证circGLIS2在结直肠癌中的研究价值，作者在结直肠癌细胞系中对circGLIS2的水平进行了定量分析，结果发现circGLIS2在结直肠癌细胞系中的表达与正常细胞系（图1C）和结直肠癌相关的circRNAs数据集（图1D）相比均增加。
图1 CircGLIS2的筛选与验证
2. Circ-GLIS2的来源及结构验证
为了了解Circ-GLIS2的潜在功能，作者查找了Circ-GLIS2的来源基因GLIS2的相关信息，通过查找文献了解到GLIS2发挥转录因子的作用并可能根据细胞所处的环境作为癌基因或抑癌基因发挥作用。有证据表明GLIS2还可作为融合基因参与癌症的发展。
为了验证circGLIS2是由GLIS2基因转录本的反向剪接产生的circRNA，作者进行了一系列实验：首先，作者设计发散（红色）和收敛（蓝色）引物（图2A）；接着，分别使用发散和收敛引物对转录组补体DNA（cDNA）和基因组DNA（gDNA）应用PCR，结果发现收敛引物可从两种DNA模板中扩增出GLIS2，而发散引物扩增了仅存在于cDNA模板中的序列（图2B）；其次，使用RNase R处理来验证circGLIS2的环状形式（图2C）；最后，为了验证circGLIS2的稳定性，作者使用了放线菌素D（ACT-d）来抑制新的RNA合成，结果发现circGLIS2在细胞内比线性GLIS2 mRNA更稳定（图2D）。
图2 CircGLIS2是由GLIS2基因转录本的反向剪接产生的circRNA
3. CircGLIS2调节结直肠癌细胞迁移
为了研究circGLIS2在结直肠癌中的作用，作者做了功能增益实验：首先，作者将circGLIS2序列克隆到circRNAs表达载体中，该载体由反向剪接位点上的两个环化元件组成（图3A）；其次，作者设计了针对circGLIS2反向剪接位点的特异性qPCR引物，以检测circGLIS2的表达。qPCR分析结果证明circGLIS2在DLD1和HCT-8 结直肠癌细胞系中稳定过表达（图3B）；最后，作者对circGLIS2过表达的细胞进行transwell分析以测试其细胞迁移属性。结果显示，cricGLIS2的过表达促进了DLD1和HCT-8 结直肠癌细胞系的细胞迁移（图3C，D）。
为了进一步验证circGLIS2的作用，在功能增益实验的基础上，作者又做了功能丧失实验：首先，作者设计了两个专门针对反向剪接位点的siRNA（图3E）；其次，作者通过RT-qPCR验证了siRNA的已知效率。结果显示，si-1和si-2均可降低DLD1和HCT-8细胞系中circGLIS2的表达（图3F）；接着，transwell实验证实了circGLIS2的下调抑制了DLD1和HCT-8细胞系中的细胞迁移（图3G，H）。
结合功能增益和丧失实验的结果，作者得出结论：在结直肠癌细胞系中circGLIS2的过表达或沉默表达分别显著促进或抑制了细胞迁移。circGLIS2通过调节癌细胞的迁移参与了结直肠癌的发展。
图3 CircGLIS2通过调节癌细胞的迁移参与了结直肠癌的发展
4. NF-κB信号通路参与circGLIS2调控的细胞迁移
为了探索circGLIS2影响细胞迁移的分子机制，作者使用κEGG分析筛选了可能参与circGLIS2功能的信号通路，得到circGLIS2过表达诱导的差异表达基因主要参与TNFα和NF-κB信号通路（图4A）。
作者选取了NF-κB信号通路作为研究对象。为了探究circGLIS2与NF-κB途径的调控关系，作者从NF-κB反应元件（NF-κB-RE）和p65入手检测了在不同circGLIS2表达的情况下该通路的活性变化：双荧光素酶实验表明NF-κB信号在DLD1细胞中过表达的circGLIS2转染后被激活（图4B）；蛋白质印迹显示，磷酸化的p65（p-p65）的水平在circGLIS2过表达后有所增加（图4C），circGLIS2的过表达增加了p65的核定位（图4D）。为了进一步证实circGLIS2调控的迁移作用是通过NF-κB信号通路引起的，作者应用了p65靶向的siRNA来降低p65的水平（图4F）并发现在p65敲低情况下促迁移作用被消除（图4E）。这些数据表明NF-κB信号通路参与circGLIS2调控的细胞迁移。
图4 NF-κB信号通路参与circGLIS2调控的细胞迁移
5. CircGLIS2通过自分泌机制增强结直肠癌细胞的NF-κB信号通路和细胞迁移
以上数据表明，circGLIS2是NF-κB信号通路的潜在调节剂，由此作者提出假设：circGLIS2过表达的癌细胞通过构建肿瘤相关的微环境（TME）来调控癌症的发展。
为了验证该假设，作者检测了在circGLIS2过表达条件下结直肠癌细胞中NF-κB的活性和p65磷酸化水平。结果发现NF-κB的活性（图5A）和p65磷酸化水平（图5B）较对照组相比均有提高。为了进一步研究circGLIS2相关的微环境和癌细胞运动之间的相互作用。作者设计了一种用于在条件培养基处理后测量细胞迁移的体外模型（图5C）， 应用该体外模型和transwell测定法，作者发现circGLIS2过表达条件赋予培养基结直肠癌细胞更高的运动能力（图5D）。总体而言，作者的数据表明，过量表达circGLIS2的细胞上清液足以激活NF-κB信号通路并促进细胞运动。
图5 CircGLIS2通过自分泌机制增强NF-κB信号通路和细胞运动潜能
6. CircGLIS2过表达的结直肠癌细胞通过自分泌和旁分泌方式扩增趋化因子环境以招募中性粒细胞
为确定哪些因素促成肿瘤微环境，作者进一步分析了circGLIS2过表达引起的差异表达基因的特定基因组（图6A）。值得注意的是，与载体对照细胞相比，DLD1-circGLIS2细胞中某些趋化因子（CXCL1，CXCL8和CCL20）的表达升高，这可以通过敲除circGLIS2来证实（图6B）。接下来，作者研究了circGLIS2过表达细胞的条件培养基是否也可以诱导结直肠癌细胞中CXCL1和CXCL8的表达，结果果然显示，CXCL1和CXCL8的表达显著增加（图6C）。该数据表明circGLIS2过表达细胞通过自分泌方式扩增了TME内的趋化因子环境。已知CXCL1和CXCL8是嗜中性粒细胞的趋化因子，作者由此提出假设：circGLIS2过表达细胞通过构建肿瘤相关的微环境募集白细胞。
为了验证该假设，作者设计了一种体外趋化性检测法，以评估circGLIS2相关微环境的细胞间作用（图6D）。作者通过ACκ裂解过程从健康的供体中收集白细胞并将其添加到上腔室中，同时将cricGLIS2过表达细胞或载体对照细胞的上清液添加到下腔室中。出乎意料的是，circGLIS2过表达的条件培养基将更多的细胞募集到下腔室中（图6E）。此外，作者通过流式细胞仪鉴定了上腔室和下腔室中白细胞的特性，发现circGLIS2过表达的细胞上清液在下腔室中吸引了更多的CD15 +中性粒细胞。此外，沉默circGLIS2抑制了白细胞对细胞上清液的趋化性（图6F）。这些结果表明，cricGLIS2细胞通过自分泌和旁分泌方式形成了一个独特的肿瘤微环境，并且该微环境富含中性粒细胞。
图6 circGLIS2过表达细胞通过构建肿瘤相关的微环境募集白细胞
7. CircGLIS2 通过结合miR-671激活NF-κB信号通路
为了进一步探索circGLIS2激活NF-κB信号通路的分子机制，作者首先确定circGLIS2在结直肠癌细胞中的亚细胞位置。对亚细胞分离RNA的qPCR分析表明，circGLIS2主要存在于结直肠癌细胞的细胞质中（图7A）。FISH实验也显示了相同的结果（图7B）。细胞质circRNA的许多可能机制已经被报告包括海绵状miRNA和与其他RNA结合蛋白相互作用。作者使用CircInter actome数据库分析了circGLIS2的蛋白质结合功能。结果表明circGLIS2可能与非常常见的miRNA相互作用蛋白AGO2相互作用。沿着这条线，作者又做了RAP分析，其结果进一步表明抗AGO2抗体确实富集了circGLIS2（图7C）。因此，作者推测circGLIS2可能通过与miRNA相互作用而起作用。
图7 CircGLIS2 通过结合miR-671激活NF-κB信号通路
为了验证这一假设，作者使用了CircInteractome生物信息学数据库来预测可能与circGLIS2结合的miRNA。根据配对序列的数目和TargetScan miRNA的得分，选择了三个miRNA用于Transwell分析验证。在候选miRNA中，miR-671显著抑制DLD1细胞中的细胞迁移。为了检测结直肠癌组织中miR-671的表达，作者参考了TCGA数据集，并发现miR-671在结肠和直肠腺癌中被下调。此外，作者通过查阅文献得知miR-671可调节癌症发展和免疫调节。作者使用了双重荧光素酶报告系统来验证circGLIS2和miR-671之间的相互作用。双重荧光素酶报告基因测定表明，与circGLIS2-WT和miR-671共转染后，相对荧光素酶活性降低了（图7E）。作者评估了miR-671转染后细胞中NF-κB通路的活性，发现miR-671抑制了DLD1细胞中的NF-κB信号传导（图7F）。为了研究circGLIS2是否通过miR-671发挥其功能，作者对存在miR-671剂量转染的circGLIS2异位表达细胞进行了回复实验，结果显示miR-671逆转了circGLIS2上调结直肠癌细胞中p-p65的能力（图7G）。同样，miR-671逆转了circGLIS2促进DLD1和HCT-8细胞迁移的能力（图8A, B）。然而，作者在细胞趋化性实验中未观察到明显的逆转作用（图8C）。这些发现表明，circGLIS2可以与miR-671结合以增加NF-κB信号通路的活性并促进自身的迁移。
图8 MiR-671减弱了circGLIS2在细胞迁移中的功能，但不影响趋化性
研究总结
本文利用经典的环状RNA的研究方法，即从微阵列测序的方法筛选得到目标环状RNA circGLIS2，确认circ-HER2的存在，接着进行功能验证并探索其发挥作用的方式及分子机制。这一系列细致完整的实验证明了上调的circGLIS2通过激活NF-κB信号通路和募集白细胞促进了结直肠癌的转移， 并解释了其中的分子机制，即circGLIS2充当“ miRNA海绵”来抑制miR-671功能并因此调控NF-κB信号通路发挥作用。这让circGLIS2成为一个潜在的结直肠癌治疗靶点。这些发现突显了结直肠癌促转移微环境的构建中NF-κB和circGLIS2之间的新机制联系。这些结果可能会对结直肠癌预防和治疗提供新的见解，在临床上具有重要意义。
文章中主要研究因子及因素间的二元关系
参考文献
1. Chen J, Yang X, Liu R, Wen C, Wang H, Huang L, Li W, Zhu Z, Zhu Y, Liu H. Circular RNA GLIS2 promotes colorectal cancer cell motility via activation of the NF-κB pathway. Cell Death Dis. 2020 Sep 23;11(9):788. doi: 10.1038/s41419-020-02989-7. PMID: 32968054; PMCID: PMC7511409.