2020年9月7日，大连医科大学肿瘤中心的金必连教授在Molecular Cancer （IF=15.302）发表了一篇题为“Circular RNA CDR1as disrupts the p53/MDM2 complex to inhibit Gliomagenesis ”的文章，提示了环状RNA CDR1as的新功能，通过破坏P53/MDM2复合物从而限制p53蛋白的泛素化来促进其稳定性，最终达到显著的胶质瘤抑制效果[1]。
研究背景
胶质瘤是中枢神经系统常见的肿瘤，其中多形性胶质母细胞瘤最为常见且具有侵袭性，复发率高，总体生存率低的特点。抑癌基因p53的失活在胶质瘤，特别是在多形性胶质母细胞瘤(GBM)的发病机制中起着至关重要的作用。MDM2是p53的主要负性调控因子，它可以与p53结合并与其形成稳定的复合物，影响其活性。到目前为止，p53/MDM2复合体的稳定性是否受到lncRNAs的影响尚不清楚。环状RNA是一种丰富而保守的lncRNA，经常被报道与不同的肿瘤发生过程相关。因此，探寻p53是否与lncRNAs，尤其是环状RNA的相互作用，以及相关的生理意义对于GBM的潜在发病机制至关重要。
环状RNA CDR1as的筛选及特征
首先，作者通过RIP-seq和RIP-qPCR技术并结合Spearman相关性分析，发现CircRNA CDR1as在U87MG细胞中与p53的丰富结合，并且与p53信号通路显著相关（图1a，b，c）。随后，分析CGGA的数据表明，CDR1as在胶质瘤中的表达明显下调，与WHO组织病理学标准定义的分级呈负相关，作者进一步通过RT-qPCR分析在胶质瘤组织（n=45）中证实了这一点（图1d，g）；另外，CDR1as的表达与胶质瘤患者的总体生存率呈正相关（图1e）。同时，AUC结果表明CDR1as可以作为预测胶质瘤危险率的可靠因子（图1f）。接下来，作者通过RIP-seq、RNA FISH与蛋白质IF结合的方法进一步证实了CDR1as与p53具有很强的相互作用，与p53信号转导密切相关(图1h，i，j)。
CDR1as在蛋白水平调节p53活性
上述结果提示，CDR1as不仅与p53蛋白紧密结合并可能具有调节p53蛋白的水平的功能。为了进一步研究CDR1as的功能，作者在U87MG和LN229细胞中，研究了CDR1as对P53的表达及转录活性的影响。结果显示，P53蛋白与CDR1as含量呈正相关依赖性（图2a，b）。另外，在CDR1as敲低的情况下，使用p53-MDM2 抑制剂Nutlin3后，p53蛋白水平回复（图2c）。然而上述处理中p53的mRNA水平并没有受到CDR1as变化的影响（图2a，b），这提示我们CDR1as直接在蛋白水平上促进P53蛋白表达，并非通过mRNA途径。作者接下来研究了P53的转录活性是否受CDR1as的影响，P53荧光素酶报告实验证实CDR1as可以作为p53的转录活性正向调控因子（图2a，b）。此外WB和IF检测到CDR1as敲低后P53细胞核特异性下调，最终结果提示CDR1as可能通过与p53的相互作用，在蛋白水平上调p53的表达，从而促进p53信号的激活。
CDR1as调控p53不依赖RNA Sponge功能
由于CDR1as序列中有多个miRNA连接位点，因此CDR1as被认为主要作为海绵体结合不同的miRNAs，特别是miR-7。CDR1as是否通过其结合miRNA尤其是miR-7的能力调控P53表达？为了验证这一猜想，作者敲低了miRNA发生成熟必需的AGO2或DICER基因，此时p53及p21在mRNA和蛋白水平以及转录活性均受到了抑制。然而CDR1as过表达仍显著上调了上述细胞中p53和p21的蛋白水平，有趣的是，其mRNA的水平并未发生改变。此外无论CDR1as敲除与否，miR-7抑制剂对p53蛋白的表达均没有影响。这些结果表明CDR1as调节p53蛋白的功能部分独立于它与miRNAs，特别是miR-7的结合能力。
CDR1as通过抑制泛素化稳定p53蛋白
CDR1as既不能提高P53mRNA水平又似乎不结合miRNA发挥作用，那它究竟如何调控P53蛋白？接下来作者便研究了CDR1as对p53蛋白降解的影响。当CHX阻断蛋白合成时，P53会随时间推移而降解。将编码CDR1as的质粒和对照质粒转入CHX处理的GBM细胞，与对照组相比，CDR1as显著抑制了P53降解（图2e），相应地干扰CDR1as，p53蛋白的降解会增加（图2f）。这表明CDR1as很可能通过抑制P53的降解而显著提高了P53的稳定性。众多以往的研究表明，p53蛋白主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。因此接下来作者验证了P53的泛素化与CDR1as水平呈显著的负相关性（图2g，h），显然上述结果表明：CDR1as可以抑制p53的泛素化，从而有效阻止p53蛋白的降解。
CDR1as干扰p53/MDM2复合体
为了分析p53不同结构域的结合能力，作者设计了四种不同的P53结构域。如图3a，分别为p53 、ND2（缺失两个N-末端结构域）、CD1（缺失两个C-末端结构域) 和MD1(缺失DBD结构域)。RIP-qPCR检测结果表明只有缺少DBD结构域的结构才失去了与CDR1as结合的能力，这表明p53的DBD是CDR1as结合所必需的(图3b)。
p53蛋白受到其负调控因子MDM2的严格调控，MDM2是E3泛素蛋白连接酶，它可以形成p53/MDM2复合物，促进p53泛素化和降解。因此作者接下来验证了CDR1as是否通过影响p53/MDM2复合物的形成来调控p53蛋白的表达。随后的IP实验证实CDR1as以剂量依赖的方式显著抑制p53与MDM2的相互作用(图3c,d)。另外的分析结果表明MDM2不直接与CDR1结合，因此作者接下来研究CDR1as是否通过结合p53蛋白来破坏p53/MDM2复合体。为此将编码MDM2和不同p53突变结构（图3a）的质粒导入MEF DKO细胞中，WB检测MDM2和不同p53突变结构的相互作用。最终的实验结果表明MDM2与全长P53和CD1及MD1突变结构结合（图3e-h），当CDR1as过表达时，MDM2与全长P53和CD1的相互作用被显著抑制，相反，对缺乏DBD结构域变体的CD1影响不大。进一步实验验证了，只有在DBD结构域完整的情况下，CDR1as才能有效地破坏内源性MDM2与p53的结合。这表明，CDR1as可能是与P53的DBD区域结合，有效阻碍了p53/MDM2的形成，从而抑制了P53蛋白的降解。
CDR1as在体内外抑制胶质瘤的形成
上述结果表明，CDR1as可以调控抑癌因子P53的蛋白水平。因此CDR1as可能在抑制胶质瘤的发生中起着重要的调节作用。体外结果证实U87 MG细胞的增殖、分裂、以及克隆形成均和CDR1as的表达呈显著负相关（图a-c），而CDR1as的表达促进U87 MG细胞的凋亡（图d）。此外通过建立裸鼠移植瘤模型评价了CDR1as在体内胶质瘤发生中的作用。与体外结果类似，过表达CDR1as有效逆转了CDR1as敲低诱导的细胞增殖、肿瘤体积增加，裸鼠存活率和p53蛋白下降等现象(图4e-h)。综上所述，CDR1as在体内外均有显著的肿瘤抑制作用。
CDR1as以p53依赖的方式发挥作用
CDR1as能稳定p53蛋白，显著抑制肿瘤生长。此外，上述结果表明，CDR1as通过与p53的DBD区域结合发挥作用。接下来作者探讨了CDR1as的功能是否依赖于p53。因而比较了CDR1as过表达(图5a)或下调(图5b)在p53功能正常(p53+/+)或缺失(p53−/−)的细胞中的影响。在HCT116 p53+/+细胞中CDR1as的过表达显著抑制了克隆形成和细胞增殖，而CDR1as被敲低时促进了克隆形成/细胞增殖（图5c，d）。进一步流式结果证实CDR1as促进HCT116p53+/+细胞G0/G1期阻滞和凋亡，而对HCT116p53−/−细胞影响不大（图5e，f）。此外，CDR1as的变化对P53突变或失活细胞的周期/增殖/克隆没有显著影响。综上结果表明CDR1as依赖于与P53的结合来抑制胶质瘤的发生。
CDR1as保护p53功能免受DNA损伤
作者发现CDR1as和p53的表达水平在DNA损伤（Dox0和VP16处理）细胞中显著升高（图6a），意味着CDR1as和p53信号在DNA损伤时被同时激活。CDR1as与p53紧密共存于细胞核中，CDR1as促进DNA损伤细胞中p53的积累，表明它可能是保护p53功能以应对DNA损伤的关键(图6b)。流式细胞仪分析证实细胞G0/G1期阻滞(图6C)和凋亡(图6D)在Doxo处理的U87MG细胞中受到抑制，相反，而CDR1as的增强表达促进了U87MG细胞周期阻滞和凋亡。为了进一步证实CDR1as对DNA损伤的影响。接下来对反映损伤程度的磷酸化组蛋白H2AX位点进行IF检测结果证实CDR1as的敲低促进了H2AX蛋白位点的形成(图6e)，过表达CDR1as则显著抑制H2AX的形成。综上所述，CDR1as不仅是DNA损伤的感受器，也是DNA损伤反应的中介。在DNA损伤时，CDR1as被诱导来保护和稳定p53，并减少损伤DNA的积累。
参考文献
1. Lou, J., Hao, Y., Lin, K. et al. Circular RNA CDR1as disrupts the p53/MDM2 complex to inhibit Gliomagenesis. Mol Cancer 19, 138 (2020). https://doi.org/10.1186/s12943-020-01253-y