近日，东南大学顾万君教授团队在Protein&Cell杂志发表综述，总结了血液环状RNA作为人类疾病液体活检标志物的潜力[1]。

液体活检是一种使用人体体液作为样本的检测方法，可以预测和监视人类疾病的发展。与传统的组织活检方法相比，液体活检具有侵害性小，实时检测和准确性高等优势，也因此已经应用于如癌症、产前遗传病、心脏病、精神分裂症、移植排斥和感染病等疾病的检测。至今，液体活检的标志物有体液循环中的肿瘤细胞（CTCs）、代谢物、蛋白、血小板、胞外囊泡、cfDNA和cfRNA。其中，由于RNA的动态表达以及与不同疾病状况密切相关性，因此基于RNA的液体活检已经越来越受到重视。

环状RNA（circRNAs）是前体RNA通过首尾反向剪切形成的共价闭环结构。与mRNA相比，环状RNA缺少5’帽子和3’ployA尾。circRNAs在几乎所有的真核生物中存在，并且其表达具有组织或细胞特异性。circRNAs的异常表达与许多人类疾病相关，包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和免疫性疾病等。由于circRNAs高度稳定性、广泛的表达以及高度特异性等特点，其正在成为极具前景的人类疾病标志物之一。

基于液体活检标志物在精准医疗的重要性以及circRNAs作为生物标志物的优越特性，circRNAs作为人类疾病的液体活检标志物的潜力也越来越多的被研究。因此，作者集中总结了外周血中的circRNAs作为疾病标志物的研究。为了更全面的了解circRNAs作为人类疾病的液体活检标志物的潜力，作者从circRNAs的形成、功能、表达模式、与疾病的关系、在血液组分中的作用以及应用前景这几个方面进行了总结。

CircRNAs的形成

circRNAs来源于前体RNA，并通过下游5’剪接位点与上游3’剪接位点共价连接形成。circRNAs主要分为3种类型：外显子circRNAs（ecircRNAs）、外显子-内含子circRNAs（EIcircRNAs）以及环化的内含子RNA（ciRNAs）（图1）。EcircRNAs，顾名思义，是由外显子形成的，大多数定位于细胞质。EcircRNAs的形成有2种机制。一是在转录过程中前提mRNA进行部分折叠时，传统的剪接导致“外显子跳跃”并生成跨越的外显子的套索状RNA，随后通过反向剪切将套索结构的中间体剪切为环状。二是5’剪接位点与3’剪接位点通过内含子序列互补或与内含子序列互补的结合蛋白的作用拉近，随后通过反向剪切成环。顺式作用元件和反式作用因子在这个过程中都起了关键作用。EIcircRNAs是由于一个或几个内含子在反向剪切过程中保留下来而形成的，因此可以被认为是ecircRNAs的中间体。CiRNA仅包含内含子，是在反向剪切过程中脱去的内含子套索分支而产生的。与ecircRNAs不同，EIcircRNAs和ciRNA主要位于细胞核中。

图1 circRNAs的形成和功能

CircRNAs的功能

1. MiRNA结合

CircRNAs最为熟知的功能就是作为miRNAs海绵以调控miRNA的水平，进而影响miRNA靶基因的表达。例如，Cdr1as可以通过miRNA反应元件与mRNA竞争结合miR-7，进而影响mRNA的表达。

2. 蛋白调控

除了结合miRNAs，circRNAs也可以与蛋白或蛋白复合物结合调控蛋白的表达和功能。主要可以分为以下3个方面：

（1）circRNAs能够竞争性结合一些RNA结合蛋白（RBPs）。如第一个被发现具有RBPs海绵功能的circMbl，它能够与MBL蛋白结合。MBL表达可以促进circMbl的反向剪接，并导致线性MBL转录本的表达减少，同时，circMbl可以将MBL隔离在细胞质中并阻止其执行剪接功能。

（2）circRNAs可以与其他RNA和蛋白质形成复合物以发挥功能。一些包含内含子的circRNAs如circEIF3J 和 circBPTF，它们可以与U1 snRNP结合形成一个RNA-蛋白复合物，进而在其母本基因的启动子区域与RNA聚合酶II（Pol II）相互作用并增强其转录。

（3）circRNAs与蛋白质的相互作用可以促进或阻断其结合蛋白的功能。如升高circFoxo3在细胞质内的表达会影响抗衰老蛋白ID1、转录因子E2F1、抗应激蛋白FAK和HIF1α这些蛋白的核转运及其功能，导致细胞衰老。

 

3. 翻译

一些具有内部核糖体进入位点（IRES）的circRNAs可以利用起始密码子，以不依赖帽的方式进行翻译，如circMbl和circZNF609。circRNAs的N6甲基腺苷（m6A）修饰也可促进circRNAs的翻译起始。这些circRNAs的翻译蛋白可能与人类心脏的生理作用，癌症的发生发展有关。

CircRNAs的表达及其在疾病中的功能

鉴于circRNAs的重要作用，它们的表达可能为理解生物学过程和疾病发生发展的潜在机制提供重要线索。至今的研究已发现circRNAs在哺乳生物的组织和细胞中广泛表达，并在脑和血液中富集。circRNAs的表达水平则具有组织细胞特异性并和年龄有关，并且circRNAs的表达会随着时间改变的动态表达，这些circRNAs的表达变化与神经元分化、神经系统发育、人类末梢B细胞分化和精子产生密切相关。

circRNAs的时空表达是在circRNAs生成和降解之间动态平衡的，在转录水平和转录后水平上都可以进行调节。circRNAs的生成被内含子补回序列（ICSs），顺式剪切原件和反式作用因子调控，而 circRNAs的降解则与miRNA引发的AGO2裂解和核酸酶介导的裂解有关，包括RNase L核酸内切酶，RNase P / MRP核酸内切酶复合物和G3BP1核酸内切酶。circRNAs生成或降解异常导致细胞或组织中circRNAs表达异常，这可能与许多人类疾病有关。如在结肠癌中，Cdr1as的过表达抑制肿瘤抑制因子miR-7的活性，从而导致致癌基因EGFR和RAF1的激活。

图2 外周血circRNAs可作为液体活检潜在的疾病标志物

CircRNAs作为人类疾病标志物的优势

现在我们已经了解了circRNAs的形成、功能、表达以及在疾病中具有重要作用，那么circRNAs作为人类疾病标志物，与其它标志物相比，它的优势是什么？作者总结为以下3个方面：

1. circRNAs因其末端的闭环结构比线性RNA更为稳定。如在MCF10A人乳腺上皮细胞系中， circRNAs的半衰期至少是线性RNA的2.5倍。

2. circRNAs在组织中广泛表达，其中部分circRNAs的表达水平比起对应的线性RNA更高。

3. circRNAs的表达呈组织以及不同发育阶段的特异性，更重要的是，circRNAs的组织特异性要高于其宿主基因的mRNA的组织特异性。

以上这些特征表明，当circRNAs用作生物标志物分子时，相比于其它分子，可能具有更好的分析有效性，包括分析特异性，准确性，再现性和可重复性。至今，已经有许多circRNAs被作为人类疾病的生物标志物，如Cdr1as被作为结肠癌患者的预后标志物；hsa_circ_101308、hsa_circ_104423、hsa_circ_104916和hsa_circ_100269可以预测术后III期胃癌（GC）患者的早期复发；circ-AURKA和circAMACR，可作为神经内分泌前列腺癌的潜在诊断标志物。

血液circRNAs与液体活检

液体活检现已成为疾病检测领域的革命性工具，为人类疾病的诊断，预后和治疗指导都提供了重要支持。与尿液，唾液或脑脊髓液相比，外周血已被用作液体活检的主要体液（图2）。血液circRNAs可分为外周血细胞外circRNAs和血液细胞中circRNAs。外周血中细胞外circRNAs是指血浆，血清和血液外泌体中的circRNAs，是不同组织细胞分泌到血液中的，因此可以指示组织的临床特征。而血液细胞中的circRNAs是指单核细胞，红细胞，嗜中性粒细胞和血小板以及不同血细胞混合物如淋巴细胞，PBMC和全血中的circRNAs，可以指示宿主的免疫状态。

1. 外周血细胞外circRNAs

circRNAs在血浆和血清中广泛表达，在这其中，外泌体和微囊泡的circRNAs具有很大的诊断和预后价值。如在MHCCLM3肝癌细胞及其外泌体中，外泌体中富集的circRNAs至少是细胞中的2倍。而血小板也被证明可以选择性释放特异性circRNAs到外泌体和微囊泡中。这些血液中的囊泡可以从许多不同生物系统的细胞中分泌出来，并可以通过血液循环到受体细胞，因此，细胞外circRNAs可以在许多生物学过程中发挥至关重要的作用，例如癌细胞增殖、癌症转移、耐药性、止血和炎症。如脂肪分泌的外泌体中发现的circ-DB可以竞争性结合miR-34a并激活肝细胞癌（HCC）患者血浆样品中的USP7来调节去泛素化，从而减少DNA损伤并促进HCC 细胞生长。

迄今为止，已有许多外周血细胞外circRNAs用于癌症治疗，包括早期癌症诊断，癌症预后和癌症治疗预测。如人血浆中的hsa_circ_0000190，可以预测肺癌患者的生存结果；血清外泌体中的circFLI1水平在小细胞肺癌患者中显着升高，具有预测预后预测的潜力。除了异常表达的外周血细胞外circRNAs，一些融合的circRNAs（f-circRNAs）也可以作为液体活检的标志物，如F-circEA仅在EML4-ALK融合患者的血浆中表达，因此可以作为诊断NSCLC患者的液体活检标志物。表1详细总结了至今外周血中细胞外circRNAs的研究。

表1 外周血细胞外的circRNAs标志物

2. 全血和血液细胞中的circRNAs

全血和血液细胞中的circRNAs主要在免疫反应及其调控中起着至关重要的作用（图3）。首先，circRNAs对血液细胞的生成、分化和激活其重要的调控作用，如circANRIL可以与PES1结合以阻止前rRNA和核糖体的生成，从而通过p53激活导致巨噬细胞的生物发生。其次circRNAs可以参与抗病毒免疫反应，如人circRNAs的m6A修饰可抑制先天免疫，而未修饰的circRNAs和K63-多聚泛素可激活RIG-I和先天免疫应答。两种免疫因子NF90 / NF110不仅促进细胞核中circRNAs的产生，而且与成熟的宿主circRNAs结合，在细胞质中形成circRNP复合物，在病毒感染后，细胞质中的circRNP复合物可以释放NF90 / NF110，该蛋白与病毒mRNA结合以抑制病毒复制。最后，circRNAs与抗菌免疫反应也密切相关，如circRasGEF1B作为LPS反应的正调节剂可以在TLR4 / LPS途径中诱导ICAM-1的表达，从而激活病原体识别和微生物感染后的炎症反应。

图3 CircRNAs参与宿主对外源病原体的免疫反应
血液细胞中circRNAs的表达失调可能有助于免疫相关疾病的发生和发展，包括自身免疫性疾病，传染病和心血管疾病。如hsa_circRNA_001937可能通过靶向miR-26b和调节NF-κB途径参与炎症反应；而circPOLR2A的过表达可抑制PKR激活、EIF2α磷酸化和I型IFN诱导的基因表达。随着对血细胞circRNAs及其功能的认识的不断提高，血细胞或全血中的许多circRNAs已被提议作为人类疾病的液体活检生物标志物。如结核病患者中hsa_circ_001937在PBMC中的表达明显高于肺炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺癌患者；肝癌患者PBMCs中 circ_0000798表达上调，并且circ_0000798的表达与存活率有关；hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090，可以将SLE儿童与健康对照区分开来；hsa_circ_0054633可作为糖尿病前期和T2DM的敏感而特异性的诊断生物标志物，以上这些分子都具有疾病诊断和预后标志物的潜力。除了这些外，对于其他人类疾病如冠状动脉疾病、获得性肺炎和精神分裂症都有血液细胞中circRNAs作为疾病标志物的相关研究。表2详细列举了关于血液细胞中的circRNAs作为生物标志物的研究。

表2 全血和血液细胞中的circRNAs标志物

总结和未来展望

血液circRNAs的高稳定性，丰度和时空特异性表达使其成为液体活检的理想生物标志物。但是，能够广泛临床应用的生物标志物必须证明其具有分析有效性和临床效用。因此，将外周血circRNAs生物标志物转化为临床实践之前，仍有一些问题值得思考和解决。

1. 基于circRNAs的血液基因测试应首先在临床相关条件下证明其有效性，另外，发现和验证血液circRNAs生物标志物的程序也亟待标准化，包括血液收集和保存，circRNAs提取，文库构建和计算分析。

2. 当前研究中鉴定的血液circRNAs仅是初步筛选，为了测试其临床有效性，需要更多的临床样本来验证其敏感性和特异性，尤其是在区分具有相似临床表型的患者中的表现。同时，它们在诊断疾病或预测疾病结果方面的表现也需要在临床实践中进行测试。

3. 需要进行进一步的研究以测试和验证这些生物标志物在临床实践中的有效性，例如其为临床决策提供信息和改善结果的能力。

尽管circRNAs作为液体活检生物标志物仍面临许多挑战和问题，但将血液circRNAs标志物在临床应用中的巨大潜力能够为我们后续的研究带来新的启发和选择。

 

参考文献

1. Wen, G., Zhou, T. & Gu, W. The potential of using blood circular RNA as liquid biopsy biomarker for human diseases. Protein Cell (2020). https://doi.org/10.1007/s13238-020-00799-3

分类： circRNA疾病标志物, 最新重要进展评论

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