12月16日，Neuro-oncology杂志（IF=10.247）在线发表了中山大学附属第一医院张弩教授最新的研究成果，报道发现EGFR来源的circRNA可以特殊的滚环翻译和程序化-1核糖体移码（-1PRF）诱导的框外终止密码子（OSC），形成一系列的滚动翻译EGFR（rtEGFR）。rtEGFR可以结合并稳定EGFR，在胶质母细胞瘤成瘤和Nimotuzumab药敏相关[1]。
circRNA虽然被划分为非编码RNA的一种，但越来越多的报道发现体内circRNA是能够被翻译成功能性多肽和蛋白的。本文作者发现由EGFR的14-15外显子形成的circRNA（hsa_circ_0080229，文中称为circEGFR）在胶质母细胞瘤中显著升高。有趣的是作者预测并验证到circEGFR中存在无限循环的ORF（iORF），翻译成一系列的83aa循环不同次数产生的特殊翻译产物，统称为滚环翻译EGFR（rtEGFR）。小鼠模型中结果显示，干扰circEGFR可显著降低BTIC细胞的成瘤能力。机制方面，rtEGFR可以结合并稳定EGFR，持续活化下游通路。体内干扰circEGFR还可以促进Nimotuzumab的药物敏感性，与rtEGFR产物有关。下面我们就一起学习一下这篇文章：
如何发现circEGFR的？
基于RNase R消化后的RNA样品进行环状RNA测序，共分析了9种细胞，其中NSC和NHA细胞为对照。分析的表达差异。共测到52646种circRNA分子，其中14531种circRNA在circBase数据库中有记录。这些circRNA大部分来自编码基因的外显子，差异分析结果表明共有244种差异的circRNA分子，其中45种circRNA为上调。circRNA母基因的通路分析结果显示EGFR在多种通络中出现。来自EGFR的一个circRNA（hsa_circ_0080229，文中称为circEGFR）在显著性差异的circRNA中排名靠前，并且是前10位差异circRNA分子中唯一一个在BTIC中上调的circRNA分子，因此本文的工作聚焦在这个circRNA分子上。
图1 环状RNA测序发现circEGFR （[1]）
设计靶向circEGFR的shRNA，验证干扰效率。分离胞质-核组份检测表明circEGFR主要定位在细胞质中。GBM标本中QPCR检测表明GBM中circEGFR显著上升，并且高表达circEGFR的患者预后更差。
图2 cricEGFR鉴定与表达分析 （[1]）
circEGFR翻译的预测与验证
circEGFR全长249nt，恰好是3的整数倍。有趣的是，作者在分析circEGFR的ORF时，发现在一个Frame中存在一种无限循环的无终止密码子的编码框（iORF），这段iORF所编码的是83aa序列无限循环的多肽，其中这83aa的序列N端与EGFR母基因567-627一致，C端与545-566一致，这两段顺次排列后无限循环。按照传统的思路，这种iORF并不符合翻译的标准（因为不存在终止密码子），但生物体内蛋白翻译机制并不会首先“判断”是否存在终止密码子才会起始翻译，更有可能的是只要符合翻译的条件（起始翻译的条件，存在起始密码子），理论上会有翻译启动的可能，最后遇到了终止密码子才终止翻译，或者还有一些尚未发现的特殊翻译终止机制。
为找到circEGFR是否被翻译的证据，作者首先分析了circEGFR是否能结合到核糖体的情况。在293细胞中分别过表达野生型和起始ATG密码子突变的circEGFR（noATG），富集核糖体的分析结果表明，EGFR的mRNA主要在heavy polysome（H）部分，野生型circEGFR主要在monosome （M）部分和light polysome （L）部分，而noATG突变型的不能在这三个部分中富集。说明野生型circEGFR可以与核糖体结合。
为进一步验证circEGFR是否有翻译，作者构建了两种circEGFR的载体，一个是在原有iORF的N端直接加上3×Flag，另一种是在这个基础上在中间的位置多加了一个A碱基，以破坏iORF阅读框。两种载体在293 细胞中过表达后WB检测，只融合3×Flag的载体检测到一系列的梯状条带，分子量大致为9kb的倍数。目前有一个商业化的抗体可以识别EGFR的424-605aa的序列，可以涵盖这个预测序列。利用这一抗体，在6对GBM的癌与癌旁组织中WB检测，也能从肿瘤组织中检测到一些类似的梯状条带产物。作者将这一系列的梯状条带产物统称为滚环翻译EGFR（rolling-translated-EGFR，rtEGFR）。进一步基于蛋白组学质谱分析，作者也找到了293T细胞过表达及456细胞中与rtEGFR吻合的蛋白肽段线索。
这种规律性的梯状条带产物如何出现的？在HIV等病毒中存在一种特殊的programmed -1 ribosomal frameshifting’ (-1PRF)机制，就是核糖体在翻译的过程中会受到程序化调控的错开一个碱基，切换到另一个Frame中进行翻译的特殊机制。circEGFR是否也有这样的机制调控翻译过程？在分析circEGFR 的序列中，作者发现了与iORF不在同一个Frame的四个终止密码子（out-of-frame stop codon，OSC），分别构建这四个终止密码子的突变体（MUT1,2,3,4），以及四个终止密码子都突变的合并突变体（MUT1-4）。融合HA标签进行过表达后WB分析，结果显示，分别突变四个终止密码子不能有效阻断梯状条带的出现，但四个同时突变的（MUT1-4）可以有效阻止梯状条带产物的产生。
图3 circEGFR翻译验证（[1]）
circEGFR通过翻译产物促进BTIC成瘤
为了分析circEGFR的功能，作者在456和4121细胞中构建了稳定干扰circEGFR的细胞株，WB显示干扰后rtEGFR的梯状条带产物明显减少。circEGFR干扰后抑制细胞增殖和克隆形成能力（有限稀释后克隆形成检测，LDA）。体内小鼠原位GBM成瘤模型表明，稳定干扰circEGFR显著抑制体内肿瘤形成，延长小鼠生存期。SW1783和HS683细胞中内源circEGFR表达不高，通过过表达野生型和iORF突变型的circEGFR（circEGFR-MUT），体外WB鉴定rtEGFR表达情况证明，circEGFR-MUT不能翻译出rtEGFR。体内成瘤实验检测过表达后成瘤的情况。两种过表达载体单独并不能促进成瘤，但如果人工补给EGFR，显著促进了野生型circEGFR的成瘤能力，但circEGFR-MUT的没有这个效应。说明circEGFR体内促进成瘤需要与EGFR协同完成。
图4 circEGFR翻译产物促进GBM成瘤（[1]）
rtEGFR结合并稳定EGFR
rtEGFR的序列与野生型EGFR的部分序列一致（545-627），这段序列在EGFR中对应为胞外的domain IV和部分跨膜区，domain IV在EGFR的寡聚化中起重要作用，rtEGFR包含了其中的一部分序列，因此作者提出rtEGFR可能通过这个结构域与EGFR蛋白相互作用的假设。为验证这一假设，作者分别构建了HA标记的EGFR，Flag标记的rtEGFR，然后分析共定位情况。结果显示两者存在共定位。CoIP也验证了这一假设，突变了domain IV的EGFR不再与rtEGFR相互作用。细胞中EGFR在EGF处理后会内内吞并降解。rtEGFR是否影响这一过程？为此，作者通过动态拍照分析了EGF处理下，456细胞中干扰circRGFR，SW1783中过表达野生型或突变型circRGFR，分析EGF处理后EGFR内吞的动态变化。结果显示，当野生型circEGFR存在的条件下，EGFR不会在EGF处理后迅速内吞和降解。而干扰circEGFR或过表达突变型circRGFR都不能阻止这一过程。这说明rtRGFR具有结合并稳定EGFR的作用。
图5 rtEGFR结合并稳定EGFR （[1]）
干扰circEGFR可增加GBM对Nimotuzumab的敏感性
Nimotuzumab是一种靶向EGFR的单抗药物，临床中表明这个药物在GBM中没有疗效，细胞实验也证明了这一现象。但在干扰circEGFR后，Nimotuzumab表现出显著的抑制肿瘤效应。体内成瘤实验也表明，稳定干扰circEGFR有一定的抑制原位成瘤能力，但同时用Nimotuzumab处理，可显著抑制体内成瘤，延长小鼠生存期。这些数据显示，circEGFR或许是GBM中Nimotuzumab耐药的重要因素，同步干扰circEGFR或许能起到Nimotuzumab增敏的作用，暗示了circEGFR具有作为GBM治疗靶点的潜力。
图6 体内circEGFR与Nimotuzumab药效有关（[1]）
本文的工作再次证明了circRNA可以翻译出有重要功能的多肽和蛋白。并且本文也首次发现circRNA中存在Frame切换的特殊翻译调控机制，对circRNA研究有重要参考意义。
参考文献
[1] Y. Liu, Z. Li, M. Zhang, H. Zhou, X. Wu, J. Zhong, F. Xiao, N. Huang, X. Yang, R. Zeng, L. Yang, Z. Xia, N. Zhang, Rolling-translated EGFR Variants Sustain EGFR Signaling and Promote Glioblastoma Tumorigenicity, Neuro Oncol (2020). 10.1093/neuonc/noaa279.