12月7日，Nature Methods发表了一项circRNA的重要技术文章，报道利用CRISPR/Cas13进行circRNA的特异性敲低，并且可以通过构建高通量Cas13文库进行功能性circRNA的筛选[1]。文章的通讯作者是中科院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲教授，李劲松教授和中科院-马普学会计算生物学研究所杨力教授。
本文首次正式报道利用CRISPR/Cas13实现circRNA的特异性敲低，筛选并鉴定到RfxCas13d是circRNA特异性最高，效率最高的Cas13体系，并系统分析了能够实现circRNA特异性敲低的RfxCas13 的gRNA设计条件。基于这些探索基础，作者还通过构建RfxCas13 高通量gRNA文库，筛选了调控细胞增殖及小鼠胚胎植入前发育相关的circRNA分子。本文的工作为广大circRNA研究同行提供了全新的基于Cas13的circRNA特异性敲低技术，并可以基于该技术设计高通量gRNA文库，对circRNA的研究有重要价值。下面我们就详细学习一下这篇文章：
Cas13特异性敲低circRNA的条件探索和验证
Cas13是可以特异性靶向单链RNA的一种CRISPR系统，基于该技术开发了线性RNA中特异性敲低和基于核酸酶结构域缺失突变的dCas13的RNA研究。circRNA也属于单链RNA分子，理论上也可以基于Cas13开发敲低和其他技术体系，但在本文之前只有两篇预印本（bioRxiv的预印本文章，其中一篇是本文的早期预印本版本）曾报道该技术在circRNA中的应用，本文是首次正式发表的基于Cas13敲低circRNA的新技术。哪种Cas13体系最适合circRNA？Cas13能否特异性靶向circRNA但对母基因mRNA不会造成影响？针对circRNA设计Cas13 gRNA的条件是什么？这些基础的技术参数是首先需要探索和验证的。本文也对此进行了系统的探索分析，详细如下：
哪种Cas13体系在circRNA中特异性和效率最高？
目前已知有多种从不同物种来源的Cas13体系，哪种最适合circRNA敲低呢？为此，作者全合成并构建了7种Cas13蛋白的过表达载体，分别是：LwaCas13a，PspCas13b，PguCas13b，RanCas13b，EsCas13d，AdmCas13d 和RfxCas13d，为提高这些基因的稳定性，作者分别在C端融合了msfGFP。在293FT细胞中分别表达这些Cas13蛋白，设计靶向KRAS的gRNA，鉴定其敲低靶分子的效率。结果表明，这些Cas13蛋白和gRNA都能在细胞中表达，对KRAS的敲低效率也非常高。
为了筛选和比较哪种Cas13体系对circRNA的特异性和效率最高，作者选择了两个circRNA作为靶分子，circPOLR2A和circRTN4，比较各种Cas13体系敲低这两个circRNA的效率和特异性。作者设计了三条跨接口的30nt长的gRNA分子。大部分Cas13蛋白都能对circRNA起到抑制作用，但不会对母基因mRNA产生明显的影响（特异性都很高）。其中RfxCas13d对circRNA的敲低效率最高。非特异性的NC对照gRNA对靶分子没有作用。单独过表达RfxCas13d或gRNA没有明显的细胞毒性效应。
图1 RfxCas13d是靶向circRNA的特异性和效率最高的Cas13体系 （[1]）
RfxCas13d体系是否存在脱靶？
无论如何设计，跨接口的gRNA至少有50%的序列是与母基因mRNA一致的，因此存在脱靶后影响母基因mRNA的风险。为分析RfxCas13d体系是否会脱靶，对母基因mRNA产生效应，作者设计了单侧突变的gRNA，这些突变的gRNA一侧15nt与circRNA接口位置的一侧一致，另一侧设计非特异性的序列（paired control）。结果显示，这种paired control分子不能对靶分子circRNA有明显的敲低影响。此外，作者还设计了10nt突变的gRNA，在KRAS和B4GALNT1的mRNA中结果显示这种10nt突变的gRNA也不能有效的敲降靶分子，说明RfxCas13d靶向靶分子的特异性非常高。
图2 BSJ单侧一致的gRNA不能介导RfxCas13d靶向circRNA （[1]）
RfxCas13d体系是否对circRNA普遍适用？
上述验证体系是在选定的两个circRNA分子中进行的，RfxCas13d对circRNA的高特异性和高效率敲低效果是否是普遍适用的？为此，作者另外选择了8种circRNA分子进行进一步的验证。结果显示RfxCas13d可以有效敲低circRNA，但对母基因mRNA没有明显的敲低效果。Hela细胞中分析七种Cas13体系后结果显示RfxCas13d是特异性和效率最高的。
图3 RfxCas13d靶向circRNA特异性和效率验证 （[1]）
RfxCas13d体系与RNAi体系相比特异性和效率如何？
基于siRNA或shRNA的RNAi是目前应用最广泛的circRNA敲低体系。RfxCas13d体系与RNAi体系相比，特异性和效率如何呢？为此，作者在同一个circRNA分子中分别设计两条gRNA或shRNA，比较不同次操作下对circRNA敲低效率及对母基因mRNA的非特异性效应的情况。结果表明，相对于shRNA，RfxCas13d体系比shRNA的敲低效率更高，对mRNA的影响更小。因此RfxCas13d体系是更特异性更高效的circRNA敲低体系。
图4 RfxCas13d体系比shRNA的特异性和效率更高（[1]）
靶向circRNA的RfxCas13d体系gRNA序列要求分析与鉴定
CRISPR体系中gRNA的长度和序列特征要求是使用这一体系的关键，为了探索靶向circRNA的RfxCas13d体系gRNA的长度，序列要求等参数，作者通过靶向circPOLR2A的不同gRNA，分析符合RfxCas13d靶向circRNA的参数要求。作者首先设计了16~36nt长度的gRNA，分析敲低效率和特异性，结果显示，gRNA必须大于18nt才能对circRNA产生敲低效果，长度大于22nt后敲低的效率比较理想，但所有长度的gRNA都没有对mRNA有脱靶效应。碱基错配对gRNA的影响也是非常重要的条件，作者分析了单个或两个碱基错配的gRNA对敲低效果的影响。结果显示，大部分单个或两个碱基错配的gRNA能显著影响RfxCas13d敲低circPOLR2A的效率。接口位点上下游8nt范围（-8 ~ +8位点）是22nt长度gRNA的核心位点，这一区域的碱基错配对敲低效率的影响更大。在接口位点上游和下游每隔10nt设计一条gRNA，分析这一系列gRNA对circPOLR2A和POLR2A mRNA的敲低效果，结果表明，涵盖了-7 ~ +7位点的gRNA对circRNA的特异性和效率更高。
图5 靶向circRNA的RfxCas13d体系gRNA重要参数分析 （[1]）
高通量RfxCas13d–BSJ-gRNA文库设计
高通量文库是筛选功能性分子的重要技术体系，RfxCas13d体系gRNA能够实现特异性敲低circRNA，如果能设计出高通量的RfxCas13d–BSJ-gRNA文库，对于分析功能性circRNA分子有重要意义。为此，作者从HT29，HeLa，293FT和H9细胞中分析了高表达的circRNA分子，作为候选分子，批量化设计了靶向这些候选分子的gRNA文库。共选择了762种circRNA分子。设计了26~30 nt长度的不同BSJ-gRNA分子，还包括了只有单侧序列一致的paired control对照。每个分子设计5条gRNA。构建了包含4572种文库分子的高通量sgRNA文库。
图6 高通量RfxCas13d–BSJ-gRNA文库设计（[1]）
高通量RfxCas13d–BSJ-gRNA文库筛选调控细胞增殖的功能circRNA分子
利用上述文库体系，作者在HT29，293FT和H9中筛选了调控细胞增殖的功能性circRNA分子。文库感染的MOI为0.3，比较了文库感染初期和培养30天后的结果。分析了在三种细胞中筛选的功能circRNA分子，汇总结果显示，大部分筛选到的circRNA是细胞株特异性的，少数circRNA在两种或三种细胞中同时被筛选到。这种细胞特异性的效应似乎与表达值没有直接关系，因为这些circRNA在三种细胞中表达量都比较接近。为此，作者进一步单独验证了敲低这些circRNA对细胞增殖的影响，结果表明的确存在细胞特异性的效应。
在筛选得到的分子中，circFAM120A在此前没有太多的报道。验证实验表明敲低circFAM120A能显著抑制细胞增殖，体内稳定敲低circFAM120A可显著降低成瘤效率。为了进一步筛选调控细胞增殖的circRNA分子，作者构建了一个新的高通量RfxCas13d–BSJ-gRNA文库，靶向2908种circRNA，这些circRNA分子在9种人类细胞系中均高表达。这种文库感染的HT29细胞接种到裸鼠中，进行体内筛选。比较体外和体内筛选的结果，有8种circRNA分子是同时被富集到的，其中就包括circFAM120A。
图7 RfxCas13d–BSJ-gRNA文库体外/体内筛选调控增殖的circRNA （[1]）
circFAM120A作用机制研究
作者进一步分析了circFAM120A的功能，作者分析了敲低circFAM120A后转录组的变化。通路分析结果表明，敲低circFAM120A可影响增殖和凋亡相关通路，包括EIF4EBP1，NUPR1，PCK2及AKT通路。circFAM120A主要定位在胞质中。PAR-CLIP的数据似乎支持circFAM120A有结合AGO2和miRNA的位点。但anti-AGO2的RIP实验没有富集到circFAM120A，因此circFAM120A可能不是通过miRNA Sponge发挥功能的。
FAM120A的mRNA干扰能有效抑制细胞增殖，作者发现敲低circFAM120A的时候FAM120A蛋白存在明显的下调。是否circFAM120A能够影响FAM120A的翻译？在Polysome profiling结果中，敲低circFAM120A会导致FAM120A由polysome结合转变为monosome结合，但对照GAPDH和SP9没有变化，提示circFAM120A可能调控了FAM120A的翻译过程。敲低circFAM120A的同时过表达FAM120A能够恢复细胞增殖能力。
基于eCLIP数据分析，作者在circFAM120A的序列中找到可能与IGF2BP2结合的位点。RNA Pull-down和RIP实验证明circFAM120A可以结合IGF2BP2。敲低circFAM120A后， FAM120A的mRNA结合IGF2BP2的能力增强。体外纯化IGF2BP2分析与circFAM120A和FAM120A mRNA的结合情况，结果表明，等量的circFAM120A可显著抑制IGF2BP2结合FAM120A mRNA。绝对定量结果显示，每个细胞中大约有250~600 copies的FAM120A mRNA，~ 22 copies的circFAM120A，但结合在IGF2BP2上的circFAM120A和FAM120A mRNA量大致相当。说明在体内circFAM120A可以有效结合IGF2BP2，并对FAM120A mRNA产生影响。RIP实验表明IGF2BP2能够更有效的结合circFAM120A。
为什么总量并不高的circFAM120A能够更有效的结合IGF2BP2呢？IGF2BP2是一种m6A的Reader蛋白，circFAM120A存在m6A的修饰，但poly-A富集的mRNA中没有测到circFAM120A所对应的FAM120A mRNA序列有m6A修饰。因此这种结合特异性可能是circFAM120A特异的m6A修饰所介导的。
进一步，基于荧光素酶分析，作者发现IGF2BP2结合FAM120A mRNA能抑制其翻译。因此，circFAM120A促进细胞增殖的机制是circFAM120A特异性的m6A修饰促进了其结合IGF2BP2的效率，通过竞争性抑制IGF2BP2结合FAM120A mRNA，促进FAM120A 蛋白翻译实现的。
图8 circFAM120A促进细胞增殖的机制 （[1]）
高通量RfxCas13d–BSJ-gRNA文库筛选小鼠胚胎植入前发育相关的功能circRNA
作者还利用高通量RfxCas13d–BSJ-gRNA文库筛选了小鼠胚胎植入前发育相关的功能circRNA。首先利用靶向Kras 和Brg1的gRNA验证了RfxCas13d体系在小鼠受精卵注射后敲低效率，结果表明该技术可以有效的进行基因敲低。进一步，作者构建了靶向24种circRNA的gRNA文库，这24种circRNA分子的15种是早期筛选实验中存在于人类细胞系中的circRNA分子，另外9种是小鼠植入前胚胎中高表达的circRNA分子。筛选实验通过在每个受精卵中注射RfxCas13d的mRNA和一种gRNA分子，共计靶向24种不同的circRNA分子的gRNA，注射到30-50个受精卵中。筛选结果表明circMan1a2对小鼠胚胎植入前发育过程有关。敲低circMan1a2可显著降低胚泡形成率，减小囊胚腔。
图9 RfxCas13d–BSJ-gRNA文库体内筛选发育相关circRNA分子（[1]）
总之，本文的数据证明了基于RfxCas13d的gRNA能够有效敲低circRNA分子，并且对母基因没有明显的影响。该体系还可以设计高通量gRNA文库，对circRNA的研究有重要意义。文中对circFAM120A调控增殖的机制研究还证明circRNA特异性的m6A修饰在circRNA功能中的作用，对circRNA研究也有重要的参考价值。
为有效帮助circRNA研究同行，吉赛生物推出了基于RfxCas13d的circRNA靶向敲低技术体系：CRISPR/CasRx。公司有胞质定位CasRx和核定位NLS-CasRx两种体系，并且可提供gRNA设计、CasRx/gRNA载体构建与病毒包装，还提供CasRx/gRNA整合型载体试剂盒，能更多的满足RNA敲低的不同需求。
参考文献
1. Li, S., Li, X., Xue, W. et al. Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system. Nat Methods (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-01011-4