值此辞旧迎新之际，首先恭祝大家新年快乐，身体健康！2020年是不平凡的一年，新冠疫情全球肆虐对社会发展造成了深远的影响，也为生物医学研究提出了更高的要求和挑战。2020年也是circRNA研究丰收的一年，相关研究论文数目飙升，高水平研究论文和综述文章大量涌现。下面就一起盘点一下2020年circRNA研究取得的主要进展：
2020年circRNA发表论文总体情况
2020年是circRNA研究丰收的一年，从PubMed中检索“circRNA”或“circular RNA”，排除不是circRNA研究的论文后共检索到1891篇文章，按照影响因子“0~5”，“5~10”和“>10”三个区间进行划分，2020年影响因子大于10的文章99篇，5~10的文章324篇，小于5的文章1468篇。近五年三个分组的文章数目如图1所示。从文章的影响因子来看，影响因子>10的circRNA文章数量有明显增长，说明关于circRNA的高水平研究越来越多。
说明：每个杂志的影响因子每年都会有变化，该统计数据中所有文章的影响因子为文章发表时杂志当时的影响因子，如后期该杂志影响因子有变，依然按原先的影响因子计算。
汇总发表过circRNA研究的杂志，可以看出一些杂志发表的circRNA论文数目相对较多，这些热门杂志可以作为circRNA研究论文投稿的参考。2020年发表circRNA文章最多的杂志Top20列表如下（表1）。值得注意的是，2020年12月31日中科院正式发布了《国际期刊预警名单（试行）》，该名单是经过综合评判期刊载文量、作者国际化程度、拒稿率、论文处理费（APC）、期刊超越指数、自引率、撤稿信息等，找出那些具备风险特征、具有潜在质量问题的学术期刊（[1]）。表1中将出现在这份预警期刊名单的杂志用红色标注出来，供同行参考。
表1 2020年发表circRNA文章数目最多的杂志Top20
2020年发表circRNA文章的学科分布情况
从学科分布统计，按照疾病相关研究、动物学、植物学、病毒学、其他物种、生命科学基础研究这几个方面大致分类，疾病相关研究占绝对优势，占总发表文章的81%（1529/1883），几个主要学科方向的分布情况如下图（图2）：
疾病相关circRNA研究分析
根据不同疾病名称，详细统计相关circRNA研究文章数目，发表circRNA研究文章数目较多的疾病列出后统计结果如下图（图3），发表文章最多的疾病Top10（表2）：
表2 2020年发表circRNA论文数目经Top10
circRNA研究技术进展概述
2020年circRNA研究出现了一些新技术方法和生信工具，这些新技术和工具有助于更高效的开展circRNA研究。其中比较有代表性的技术方法和工具汇总如下：
circRNA敲低/敲除技术：
Cas13敲低与高通量文库技术
CRISPR-Cas13可以靶向单链RNA。2020年12月7日，Nature Methods发表了一项circRNA的重要技术文章，报道利用CRISPR/Cas13进行circRNA的特异性敲低，并且可以通过构建高通量Cas13文库进行功能性circRNA的筛选。文章的通讯作者是中科院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲教授，李劲松教授和中科院-马普学会计算生物学研究所杨力教授。
本文首次正式报道利用CRISPR/Cas13实现circRNA的特异性敲低，筛选并鉴定到RfxCas13d是circRNA特异性最高，效率最高的Cas13体系，并系统分析了能够实现circRNA特异性敲低的RfxCas13 的gRNA设计条件。基于这些探索基础，作者还通过构建RfxCas13 高通量gRNA文库，筛选了调控细胞增殖及小鼠胚胎植入前发育相关的circRNA分子（[2]）。
circRNA条件诱导敲除技术
敲除模型一直以来都是circRNA研究的一个拦路虎，至今已报道的成功构建的circRNA敲除模型寥寥无几。比较典型的如中科院生物物理所范祖森团队报道的小鼠体内敲除cia-cGAS和circPan3的研究工作。2020年8月14日，中科院生物物理所范祖森和田勇团队再次发表circRNA敲除模型的研究工作，报道小鼠中敲除circKcnt2可导致ILC3细胞的活化并导致严重的结肠炎（[3]）。文章发表在Nature Communications杂志。
为分析circKcnt2在体内的生理功能，作者构建了circKcnt2敲除的小鼠模型。敲除位点为侧翼内含子中介导成环的反向互补序列，经过mini基因的验证后确认。所选择的互补序列不仅具有序列上的互补，还在进化上有一定的保守性。敲除模型中circKcnt2表达，母基因Kcnt2的表达均做了分析，可以证明实现了特异性敲除circKcnt2，而母基因没有受到影响（[3]）。
Cre条件敲低circRNA技术
4月28日，著名杂志The Journal of Clinical Investigation在线发表了一项circRNA的研究工作，报道糖尿病视网膜病变中环状RNA cZNF532高表达，与视网膜血管周细胞退化有关。cZNF532可以通过竞争性结合miR-29a-3p，促进NG2，LOXL2和CDK2的表达（[4]）。文中用到了基于Cre杂交的条件性敲低cZNF532的模型，值得circRNA功能研究中学习应用。南京医科大学附属眼科医院蒋沁，复旦大学附属眼耳鼻喉医院颜标，赵晨为本文的共同通讯作者。
Cre条件敲除模型为体内细胞特异性的功能研究提供了强大的工具，在传统mRNA基因的功能研究中扮演着非常关键的作用。circRNA目前还没有成熟的敲除体系，尤其是考虑到不影响母基因的表达，circRNA的敲除还不是非常成熟，但基于shRNA的敲降是可行的。为此，作者设计了Cre条件诱导表达shRNA的AAV载体，通过注射AAV载体到Cre模型小鼠中实现条件性敲低circRNA的动物模型（[4]）。
作者用的Cre小鼠是PDGFR-β-cre小鼠，该小鼠的Cre酶仅在PDGFR-β基因阳性的细胞和组织中表达，例如血管周细胞等等。用该基因的启动子构建的Cre小鼠也可以实现在这些类型的细胞中特异性表达Cre酶。结果显示在该模型中，可以特异性对血管周细胞的cZNF532实现条件性敲降，而血管内皮细胞中没有发生变化。在这种条件性敲降cZNF532模型中分析血管周细胞覆盖度和血管完整性，结果表明血管周细胞中敲降cANF532可以显著降低血管周细胞覆盖度和血管完整性（[4]）。
circRNA检测新技术
基于连接-PCR的circRNA定量新技术
2020年4月6日，北京科技大学李正平教授团队在Organic & Biomolecular Chemistry杂志在线发表了一项circRNA检测的新技术，基于连接反应产物的QPCR检测技术。
该技术的原理是在junction point位点两侧分别设计序列互补的DNA探针，基于RNA模板指导的DNA连接酶splintR实现两侧探针的连接，可以特异性的只在circRNA中实现连接反应，线性mRNA上两个探针不能有效接近而不能发生连接反应。该体系最低可以检测到1 fM（10^-15 M）量的circRNA（[5]），灵敏度非常高。
基于滚环反转录的circRNA检测技术
2020年5月8日，武汉大学杜宇昊团队在Analytica Chimica Acta发表了一项circRNA检测新技术，基于滚环反转录产物的circRNA检测技术（Reverse transcription-rolling circle amplification，RT-RCA）。
该技术的原理是通过滚环反转录，产物中存在多个junction point的位点，实现信号放大，然后用探针法QPCR进行检测。该技术最低能检测到1.1 fM（10^-15 M）量的circRNA（[6]）。
circRNA研究相关的数据库与生信工具
2020年circRNA相关的数据库和生信工具也取得了一些进展，其中比较重要的包括多物种circRNA的信息数据库（circAtlas），病毒circRNA信息数据库（VirusCircBase），多组学证据的可翻译环状RNA的交互式数据库（TransCirc）等等。比较重要的数据库和生信工具信息汇总如下表（表3）：
表3 重要的circRNA研究数据库与生信工具
circRNA功能机制进展概述
功能机制是circRNA研究的重要内容，相对于以往，2020年发表的circRNA研究论文中大部分涉及到了分子机制和通路，但主要聚集在竞争性结合miRNA模型，circRNA结合蛋白，circRNA翻译，circRNA修饰的研究也慢慢活跃起来。circRNA生成/降解/定位相关的研究，外泌体相关的研究也有所增加。上述几个常见的circRNA功能机制研究关键词相关的circRNA研究论文数目统计如表4所示：
表4 2020年circRNA研究主要功能机制论文数目统计
部分circRNA重要研究成果介绍
Cell：线粒体circRNA与非酒精性脂质性肝炎
2020年9月14日，中山大学孙逸仙纪念医院苏士成、许小丁和中山大学附属第三医院高志良作为共同通讯作者，在国际顶级杂志Cell在线发表了一项circRNA的重大研究成果。
免疫代谢类疾病已成为重大的公共健康问题，与高能量摄入和久坐有关，常带有炎症特征，包括非酒精性脂质性肝炎（NASH）、糖尿病、肥胖等等。代谢紊乱如何导致不可控制的炎症状态的机制目前还没有很好的解决。在脂质暴露的肝脏成纤维细胞中，作者发现了线粒体来源的ROS与促炎症表型有关。结合芯片分析的circRNA表达谱，发现了三个线粒体来源的在NASH中显著下调的circRNA分子。作者利用开发的靶向线粒体的mito-NP递送系统，过表达三个circRNA看对ROS生成和胞质/线粒体ROS量的影响情况，最终确定hsa_circ_0089762与NASH中线粒体ROS释放有关，基于后期的研究结果，作者将该circRNA命名为SCAR。SCAR直接与ATP5B相互作用，阻止ATP5B与CypD的结合并抑制mPTP的开放，进而抑制线粒体ROS的释放。利用线粒体靶向递送系统表达SCAR能抑制NASH的促炎症表型。动物模型和临床标本实验进一步验证了这些现象和机制（[7]）。
CDR1as结合IGF2BP3调控黑色素瘤进程
CDR1as是最早报道功能机制的circRNA分子，也是目前唯一实现CNS大满贯的circRNA分子。2020年1月13日，Cancer Cell杂志报道了CDR1as在黑色素瘤中的功能机制研究，表明黑色素瘤中CDR1as是由LINC00632基因的转录产物加工形成的，可以被EZH2/PRC2沉默表达。CDR1as可结合IGF2BP3，CDR1as表达降低后可释放IGF2BP3，改变一些靶基因的表达状态，参与黑色素瘤的迁移侵袭及GPX4药物敏感性（[8]）。
m6A调控circRNA生成
以m6A为代表的RNA的转录后修饰是近期研究的热点方向之一。2020年2月11日，内华达大学里诺医学院Wei Yan和Chong Tang为共同通讯作者，在Cell Research杂志在线发表了一项circRNA m6A修饰的重要文章，报道发现小鼠雄性生殖细胞发育过程中m6A修饰可促进携带ORF的circRNA的生成（[9]）。
circSKA3诱导侵袭性伪足形成，促进乳腺癌转移
2020年3月11日，Molecular Therapy杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授的最新研究成果，报道circSKA3可以结合TKS5和Integrin β1，诱导侵袭性伪足的形成，促进乳腺癌转移（[10]）。
本文发现了circSKA3可促进TKS5定位至细胞膜，与Integrin β1相互作用后促进侵袭性伪足的形成，印证了circRNA与蛋白相互作用的重要生物学功能。有趣的是同样序列的线性RNA不具有这一功能，说明circRNA具有特有的蛋白相互作用方式和功能机制（[10]）。
三阴性乳腺癌中circHER2可作为帕妥珠单抗的靶点
环状RNA具有与miRNA和蛋白竞争性结合、直接翻译蛋白和多肽等诸多功能。然而，至今对环状RNA翻译的多肽和蛋白功能的研究仍然较少，因此环状RNA的翻译也成为近年来的研究热点。2020年9月11日，中山大学附属第一医院张弩教授在Molecular Cancer发表文章，解析了一种新的HER2来源的环状RNA circ-HER2，circ-HER2约在30%的三阴性乳腺癌细胞中表达，其可以翻译出的多肽HER2–103可以促进三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭，而且 HER2–103还可以作为抗HER2靶向药物帕妥珠单抗（Pertuzumab）的靶标分子（[11]）。这一发现为一些三阴性乳腺癌病人提供了新的治疗靶点，对临床上三阴型乳腺癌患者的治疗具有重要意义。
circRNA研究需要解决的几个重要问题
2020年是circRNA丰收的一年，发表文章的数量明显飙升，大于10分的文章也有了巨大的增长。但也要清醒的看到circRNA虽然发表了很多的文章，但大部分的影响因子不太高，且存在严重的趋同现象，大部分的功能机制聚焦在竞争性结合miRNA模型，大部分的功能机制围绕细胞增殖，迁移侵袭，细胞凋亡，细胞周期等非常宏观的表型。circRNA的生理病理功能和机制依然没有非常深入的了解。根据目前已发表文章的信息，结合生物医学研究的常见问题，汇总circRNA研究常见问题如下：
（1）circRNA全序列的鉴定确认。大部分circRNA是mRNA基因的外显子经过反向剪切形成的，但多项研究表明circRNA除了有反向拼接的junction位点，中间的序列不一定与mRNA的外显子一致，存在可变剪切的现象。circRNA可变剪切是客观存在的，因此要针对特定的circRNA进行研究，就必须要知道所研究体系中这个circRNA的序列是怎样的。目前一些数据库整理了circRNA的序列，但这些序列都是默认与mRNA的外显子一致的，并没有进行序列拼接或实验验证！后面分析circRNA的表达，功能，机制都与序列密切相关。因此circRNA全序列的鉴定是进行circRNA表达，功能，机制研究的基础。但目前已发表文章似乎没有重视这个问题。
（2）circRNA表达特征的机制。大量研究表明circRNA存在细胞/组织/疾病特异性的表达特征，但这种特异性是怎样体现的？导致这些特异性的机制是怎样的？circRNA在不同组织之间的表达是怎样的关系？这些问题都还没有非常系统的解释。关于circRNA的生成/降解机制，组织特异性表达分析，泛组织表达特征分析是circRNA需要解决的重要问题。
（3）circRNA基因改造技术。模式动物中实现基因的全身敲除，条件敲除或全身过表达/条件性过表达等基因改造模型是研究基因功能非常关键的证据。circRNA在模式动物中的功能研究也需要有基因改造模型，但目前仅有少数几个circRNA做成了基因敲除模型，大部分circRNA还没有实现，最大的困难是如何确保特异性的敲除circRNA但不影响母基因。基因改造模型和技术是制约circRNA发展的一个重要障碍。
（4）功能性circRNA筛选与分析。细胞内存在几万种不同的分子，同时也存在几千上万中不同的通路和机制。这些分子如何在这些通路和机制中发挥作用的？彼此的对应关系是怎样的？这也是生命科学研究的重大问题。高通量文库筛选技术为解决这一问题提供了可行的技术方案。基于高通量功能筛选，从特定筛选模型入手，找出文库中有对应功能的分子，进而找出基因和功能的对应关系。目前已有适合circRNA的高通量文库体系，包括高通量shRNA文库，高通量Cas13d sgRNA文库，过表达circRNA文库等体系。应用高通量文库体系进行功能性circRNA的筛选分析是circRNA研究的重要发展方向。
（5）circRNA相互作用组学分析。相互作用是生物分子发挥功能的重要途径，circRNA通过与miRNA，蛋白，基因组DNA等分子的相互作用也是circRNA研究需要解决的重要问题。系统分析目标分子在体内相互作用的分子是相互作用组学研究的重要内容。circRNA的相互作用组学是circRNA研究的重要发展方向。
（6）circRNA表观转录组分析。与蛋白和DNA一样，RNA也存在多种化学修饰方式。目前已报道发现RNA中的修饰方式超过170种，这其中有多少修饰方式在circRNA中存在？各种修饰之间是怎样的关系？这些修饰的生物学功能是怎样的？这些问题都是表观转录组的研究内容，也是circRNA研究发展的重要方向。
（7）circRNA翻译组学和翻译机制研究。circRNA虽然被划分为非编码RNA，但多项报道已证明circRNA也可以翻译出蛋白或多肽，这些翻译产物在生理和病理过程中发挥了重要功能。那么有多少circRNA能被翻译？什么条件和机制介导了circRNA的翻译？circRNA的翻译产物有什么功能？这些问题都是circRNA翻译组学和翻译机制研究的内容。
（8）circRNA的亚细胞定位与示踪。细胞的空间是高度区室化的，一些细胞器和特殊细胞空间将内含分子进行空间分割，这是细胞运作的重要机制，分子的亚细胞定位是重要的功能机制。circRNA分子理论上也存在亚细胞定位的机制，目前大部分报道仅区分了细胞核，细胞质定位，少数研究分析了线粒体circRNA，外泌体中也存在circRNA分子。亚细胞定位也是circRNA功能机制的重要维度，但目前的研究还比较有限。如何实现circRNA的亚细胞定位示踪是接下来circRNA发展的一个方向。
（9）circRNA高级结构与动力学研究。生物分子发挥功能往往基于结构实现的，同一序列结构发生了变化，功能也会相应改变。circRNA分子的高级结构和动力学研究是认识circRNA功能的一个维度，也是circRNA今后发展的一个方向。
最后circRNA研究经历了从意外发现到众所周知的过程，但目前对circRNA的认识还非常有限，不论是其表达还是功能，都依然有大量的未解之谜。circRNA就像浩瀚宇宙中神秘的暗物质，暗藏着许多有趣的东西，期待各位同行一起去发现。
参考文献
1. 中科院文献情报中心分区表. 《国际期刊预警名单（试行）》正式发布. 2020.
2. Li, S., et al., Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system. Nat Methods, 2020.
3. Liu, B., et al., An inducible circular RNA circKcnt2 inhibits ILC3 activation to facilitate colitis resolution. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 4076.
4. Jiang, Q., et al., Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction. J Clin Invest, 2020. 130(7): p. 3833-3847.
5. Zhang, P., et al., Direct recognition and sensitive detection of circular RNA with ligation-based PCR. Org Biomol Chem, 2020. 18(17): p. 3269-3273.
6. Liu, Y., et al., Direct detection of circRNA in real samples using reverse transcription-rolling circle amplification. Anal Chim Acta, 2020. 1101: p. 169-175.
7. Zhao, Q., et al., Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output. Cell, 2020. 183(1): p. 76-93 e22.
8. Hanniford, D., et al., Epigenetic Silencing of CDR1as Drives IGF2BP3-Mediated Melanoma Invasion and Metastasis. Cancer Cell, 2020. 37(1): p. 55-70 e15.
9. Tang, C., et al., m(6)A-dependent biogenesis of circular RNAs in male germ cells. Cell Res, 2020. 30(3): p. 211-228.
10. Du, W.W., et al., The Circular RNA circSKA3 Binds Integrin beta1 to Induce Invadopodium Formation Enhancing Breast Cancer Invasion. Mol Ther, 2020. 28(5): p. 1287-1298.
11. Li, J., et al., Circular HER2 RNA positive triple negative breast cancer is sensitive to Pertuzumab. Mol Cancer, 2020. 19(1): p. 142.