1月14日，Nucleic Acids Research在线发表了NIH-NIA 的Myriam Gorospe博士为通讯作者的文章，报道发现circPCNX结合并调控RNA结合蛋白AUF1的功能，调控p21表达和细胞增殖。
AUF1是已知的RNA结合蛋白，之前的研究曾报道AUF1可以结合并调控一些mRNA的稳定性，也可以在细胞核中调控一些基因的转录表达。一项PAR-CLIP研究中曾报道发现AUF1可以结合一些lncRNA，但AUF1是否结合circRNA还未有相关的报道。本文作者基于RIP实验，捕获并测序鉴定到了一些与AUF1结合的circRNA，其中包括了circPCNX。
RIP捕获AUF1结合circPCNX
为分析AUF1结合的circRNA分子，作者在Hela细胞中通过RIP实验进行捕获互作RNA分子，芯片法分析了其中的circRNA。选择富集倍数大于3倍的分子，QPCR验证。共得到10个富集比较显著的circRNA分子，进一步通过RIP-QPCR验证了AUF1与这些circRNA的相互作用。由于过表达效率，干扰RNA设计，QPCR检测稳定性等因素排除了一些不太理想的分子，最终聚焦在circPCNX分子进行下一步的分析研究。
图1 RIP捕获AUF1结合的circRNA （[1]）
circPCNX的分布和鉴定
胞质-核分离后QPCR检测结果表明circPCNX主要定位于胞质中，少部分定位在核中。数字PCR（ddQPCR）绝对定量分析了特异性靶向circPCNX的siRNA和过表达载体的效率。之前的报道以及作者的验证实验表明，AUF1主要定位在细胞核中。AUF1 RIP实验表明，不管是胞质和核的组分，AUF1均能结合circPCNX。过表达或干扰circPCNX前后，AUF1蛋白在胞质和核中的分布情况。结果表明过表达或敲降circPCNX不能显著影响AUF1的定位和表达量。
图2 circPCNX定位与功能分析 （[1]）
circPCNX抑制细胞增殖
过表达或干扰AUF1是否影响circPCNX？结果表明过表达或干扰AUF1对circPCNX及母基因PCNX mRNA的表达没有明显的影响。分别过表达或敲降circPCNX和AUF1，分析细胞增殖的影响，结果表明过表达circPCNX或干扰AUF1可抑制细胞增殖效率，而干扰circPCNX或过表达AUF1则促进细胞增殖。
图3 circPCNX抑制细胞增殖 （[1]）
circPCNX抑制AUF1结合p21的mRNA
早先的研究曾报道AUF1可以结合多种mRNA或lncRNA并调控其稳定性。circPCNX是否能影响AUF1与这些RNA的结合？分别过表达或干扰circPCNX后QPCR检测CCNB1，IL6，IL8， TERT，CDKN1A（p21） mRNA以及NEAT1，分析这些RNA的变化趋势，结果表明p21的mRNA表现出显著的变化，其他的分子要么只有在一种处理条件时有变化，要么变化不显著。为什么过表达或干扰circPCNX后p21的mRNA会显著变化呢？是否通过影响AUF1的结合导致的？
过表达circPCNX后RIP检测AUF1结合的circPCNX和p21 mRNA，结果表明过表达circPCNX后结合AUF1的circPCNX增多，但p21 mRNA减少了。放线菌素D分析RNA半衰期实验显示，过表达circPCNX显著提高p21 mRNA的稳定性。QPCR和Western检测证明了过表达circPCNX能够促进p21 mRNA表达升高。干扰circPCNX则导致结合AUF1的circPCNX下降，同时p21 mRNA则上升。RNA半衰期降低，QPCR和WB检测p21表达下降。
图4 circPCNX结合AUF1，抑制AUF1结合p21 mRNA （[1]）
circPCNX结合AUF1位点分析
上述实验初步表明circPCNX可以结合AUF1，并导致AUF1对p21 mRNA的结合效率下降。为分析circPCNX结合AUF1 的具体机制，作者设计了多条涵盖circPCNX不同区域序列的生物素探针，pull-down分析circPCNX与AUF1潜在结合的区域，结果表明编号1的片段是AUF1结合的区域。进一步，作者将其中的富含AU序列的区域设计了删除，突变等突变体探针，pull-down后WB检测，结果表明，circPCNX中的一段“AUUAACUUU”序列是AUF1的结合位点（文中称为1b片段）。构建1b位点突变或删除的突变体circPCNX（分别称为circPCNX（m1b）和circPCNX（Δ1b）），分别过表达后RIP-QPCR检测被AUF1捕获的效率，结果表明1b位点突变或删除均可显著抑制AUF1结合circPCNX。这表明1b位点就是circPCNX结合AUF1的位点。
图5 circPCNX结合AUF1位点分析 （[1]）
进一步，AUF1 RIP实验中分析野生型和突变型circPCNX对AUF1结合p21mRNA的效率，结果显示，当circPCNX的1b位点突变后，AUF1结合p21 mRNA的效率恢复到空载体对照组的水平，但野生型circPCNX可降低AUF1结合p21 mRNA的效率。QPCR和WB实验分析p21表达水平也验证了这个结论。细胞增殖实验分析结果显示，过表达野生型circPCNX可抑制细胞增殖，但过表达1b突变的circPCNX没有这个效应。
图6
circPCNX影响AUF1结合p21 mRNA的3’-UTR区
早期的研究表明AUF1可以结合p21 mRNA的3’-UTR并促进其降解，circPCNX结合AUF1是否影响了这个作用过程？作者构建了荧光素酶报告基因来分析这个问题，结果显示，野生型的p21 3’-UTR构建的报告基因会由于过表达AUF1或干扰circPCNX而导致表达下降，但p21 3’-UTR中AUF1结合位点突变的报告系统不再有这种变化。P21过表达载体中携带野生型或AUF1结合位点突变型的p21 3’-UTR载体通过WB检测的实验也证明了同样的机制。细胞增殖实验进一步表明，携带野生型p21 3’-UTR的p21过表达载体会因为干扰circPCNX表现出增殖加快，但p21 3’-UTR的AUF1结合位点突变后这一效应消失。
图7 circPCNX影响AUF1结合p21 mRNA的3’-UTR区 （[1]）
参考文献：
1. Dimitrios Tsitsipatis, Ioannis Grammatikakis, Riley K Driscoll, …, Myriam Gorospe. AUF1 ligand circPCNX reduces cell proliferation by competing with p21 mRNA to increase p21 production. Nucleic Acids Res.. 2021 Jan 14;gkaa1246. doi: 10.1093/nar/gkaa1246