1月14日，Genome Biology杂志在线发表了中山大学附属第一医院张弩团队的最新成果，报道SMO基因3-6外显子形成的circRNA（circSMO）编码193aa的蛋白，调控Hedgehog信号通路，与胶质母细胞瘤肿瘤进展有关。
Hedgehog pathway（HH pathway）在早期胚胎发育中发挥重要作用，参与调控细胞增殖和干细胞分化，在成体组织中该通路关闭。但在一些人类肿瘤中，该通路会重新被激活，在肿瘤发生发展中发挥作用，其中包括了脑胶质瘤（GBM）。通常状态下，PTCH结合并抑制SMO，下游Gli在蛋白酶体中将C端降解，以转录抑制状态进入核内，抑制下游基因表达。当HH配体结合PTCH结合后释放SMO，Gli蛋白与PKA等因子与微管形成大分子复合物，导致全长Gli蛋白进入核内，激活下游靶基因的转录（[1]）。SMO在HH通路中发挥非常重要的功能，但PTCH如何调控SMO活性的机制目前认识还比较有限，胆固醇化修饰可能是重要的机制。临床中一些GBM中存在HH通路激活的情况，SMO抑制剂vismodegib在基底细胞癌（BCC）和髓母细胞瘤中有一定的治疗效果，但在GBM中的作用情况还不清楚。本文作者旨在分析GBM中可能在有功能的HH通路相关circRNA，高通量测序结果显示，SMO基因3-6外显子形成的circRNA（circSMO）在GBM细胞和肿瘤中表达显著升高，高表达circSMO的患者预后更差。机制方面，作者发现circSMO可以编码一种196氨基酸长度的蛋白（SMO-193a.a.），在sHH介导的SMO激活中发挥功能，SMO-193a.a.可以结合并促进SMO的胆固醇化。胶质瘤干细胞（GSC）中干扰cricSMO可抑制自我更新和增殖，抑制体内成瘤。作者还发现cricSMO表达受到FUS的调控，而FUS基因也是Gli1调控的下游基因，因此构成了一个基因回路。本文的发现暗示cricSMO编码的SMO-193a.a.蛋白可能是GBM潜在的治疗靶点。下面我们就一起学习一下这篇文章的主要内容：
图1 HH通路与肿瘤 （[1]）
circSMO在GSC和GBM标本中高表达
为分析HH通路在GBM中的激活状态，作者首先QPCR检测了胶质瘤细胞系，GSC干细胞中Gli1的表达情况，结果显示在GSC中Gli1的表达显著升高。通过12对GBM标本的高通量全转录组测序，作者发现了来自SMO的circRNA在GBM中显著升高，并且是表达丰度最高的Top5 分子之一。RNase R，Northern，放线菌素D实验验证了circSMO的基本特征。FISH和胞质-核分离后QPCR检测表明circSMO主要定位在细胞质中。QPCR检测表明GSC细胞中circSMO表达显著升高，临床标本检测显示GBM中circSMO表达升高，高表达circSMO预后更差。
图1 circSMO在GBM中高表达 （[2]）
circSMO可翻译196aa蛋白
蔗糖梯度离心分离核糖体组份后QPCR检测结果显示，circSMO在monosome组份中显著富集，通过过表达野生型和起始密码子突变型circSMO进一步比较显示，起始密码子ATG突变后，circSMO不再与核糖体结合。这些数据初步暗示circSMO有被翻译的可能。序列分析表明circSMO有一个跨接口位置的ORF，编码196aa的蛋白，作者将其命名为SMO-193a.a.。在该ORF上游预测有潜在的IRES序列，报告基因载体验证了这个IRES的功能。SMO-193a.a.与SMO蛋白的230-421区段一致，C端增加了一个谷氨酸。基于中间的一段氨基酸序列，作者定制了针对这一段的抗体，该抗体可以同步识别SMO-193a.a.和母基因SMO蛋白（两者都有这段氨基酸序列），区分的方法是分子量的差别。U373细胞中过表达circSMO或3691细胞中检测内源产物，WB检测能得到对应大小的条带。设计接口位点的shRNA后干扰，对应位置的条带减弱或消失，证明了内源SMO-193a.a.分子的存在以及该分子与circSMO的对应关系。3xFlag融合构建各种突变体也验证了该ORF和SMO-193a.a.蛋白的对应关系。WB检测胶质瘤细胞系和临床标本也可以检测到SMO-193a.a.的存在，GSC干细胞中SMO-193a.a.表达显著升高，临床标本中SMO-193a.a.表达高的预后更差。
图2 circSMO编码SMO-193a.a.蛋白 （[2]）
SMO-193a.a.调控GSC自我更新能力
circSMO和SMO-193a.a. 在GSC中显著升高，是否与干细胞的干性有关？自我更新是干细胞的重要特征，可以通过有限稀释分析（LDA）进行检测。结果显示，干扰circSMO后，GSC的自我更新能力下降，过表达circSMO或3xFlag融合的SMO-193a.a.可恢复自我更新能力。细胞增殖曲线，EdU掺入分析进一步验证了这一现象。WB检测了干性相关的基因。有一种可能是circSMO的RNA分子，而不是所翻译的蛋白导致了相关的表型。为排除这一可能，作者构建了起始密码子处增加一个A碱基的突变体，过表达后不改变相关的表型，证明了是SMO-193a.a.介导了GSC的自我更新。
图3 SMO-193a.a.调控GSC自我更新 （[2]）
肿瘤干细胞中SMO-193a.a.调控HH通路
456和4121干细胞中干扰circSMO前后进行高通量全转录组测序，生信分析相关的变化通路。GSEA分析显示，干扰circSMO后“Gli_Target_gene”基因集呈现显著的富集。KEGG通路分析也富集到“Wnt signaling pathway”，“ MAPK signaling pathway”，“ PI3K-AKT signaling pathway”等与干细胞干性和细胞增殖相关的通路。Gli结合位点启动子的荧光素酶报告基因证明干扰circSMO后荧光素酶的信号显著下降，而过表达circSMO或SMO-193a.a.-3xFlag促进该报告基因的表达，说明SMO-193a.a.正调控Gli通路。选择Gli1，CCND1，Myc作为Gli1通路的下游靶基因，QPCR检测和WB干扰或过表达后表达情况。结果表明SMO-193a.a.调控了HH通路。
图4 GSC中SMO-193a.a.调控HH通路 （[2]）
SMO-193a.a.结合并调控SMO活性
SMO-193a.a.的绝大部分序列与SMO蛋白共享，是否存在两者的相互作用呢？IP实验，体外结合分析证明了两者的相互作用。免疫荧光也检测到两者的共定位关系。干扰，过表达SMO-193a.a.实验表明SMO的磷酸化状态与SMO-193a.a.的表达相关。
QPCR检测PTCH1结果表明过表达SMO-193a.a.促进PTCH1的表达。过表达PTCH1可阻断由于过表达SMO-193a.a.导致的SMO磷酸化。说明PTCH1可调控SMO-193a.a.介导的SMO的活化作用。SMO蛋白分段后看是否与SMO-193a.a.能CoIP捕获，结果显示SMO的N端区域是SMO-193a.a.结合位点。这一结果暗示，SMO-193a.a.可能是通过结合并促进胆固醇转移至SMO蛋白的过程。为验证这一假设，作者利用胆固醇标记非特异性miRNA的探针（MiR-mimics-NC-cholesterol）检测这一过程，如果SMO能够被顺利胆固醇化，上面携带的miRNA分子可以通过QPCR检测得到。结果显示，过表达SMO-193a.a.能提高anti-SMO IP后miRNA探针的信号，而干扰circSMO则抑制这一信号。该结果表明SMO-193a.a.的丰度与SMO的胆固醇化状态有关。Shh在浓度梯度和时间梯度刺激下WB检测Gli1，SMO磷酸化状态的变化。结果显示过表达SMO-193a.a.可促进HH通路的活化，而干扰circSMO可抑制相关现象。
图5 SMO-193a.a.结合并调控SMO活性 （[2]）
Gli1-FUS通路调控circSMO表达
HH通路中PTCH1和Gli1既是通路中的重要分子，也都是该信号通路的下游靶基因，存在反馈放大的调控回路，上述梯度实验中可以看出，Gli1，p-SMO的变化是随着Shh浓度梯度和时间梯度递增的，那么有没有可能circSMO的表达也是受到HH通路放大表达的？作者进一步用浓度梯度条件下QPCR验证了Gli1和circSMO的表达，WB检测了SMO-193a.a.，Gli1的表达情况。结果表明当Shh处理后，Gli1和circSMO均有显著递增。序列分析表明，circSMO的侧翼有FUS的结合位点，此前有报道表明FUS可以介导circRNA的生成。因此作者通过干扰FUS看Shh刺激下circSMO的表达情况，结果表明干扰FUS后，SMO-193a.a.表达不再显著升高，而Gli1依然可以升高。
作者还发现FUS基因的上游存在两个Gli1的结合位点，荧光素酶报告基因检测表明突变其中任何一个Gli1结合位点均能显著下调FUS表达水平。ChIP实验进一步验证了这一调控机制。干扰Gli1可以抑制FUS表达。临床标本检测Gli1和FUS蛋白存在正相关性。构建稳定敲低circSMO后颅内成瘤动物模型实验结果表明，干扰circSMO后显著抑制GSC成瘤能力，干扰circSMO后过表达SMO-193a.a.-3xFlag则显著促进成瘤。
图6 Gli1-FUS通路调控circSMO表达 （[2]）
参考文献
[1] R. McMillan, W. Matsui, Molecular pathways: the hedgehog signaling pathway in cancer, Clin Cancer Res 18 (2012) 4883-4888. 10.1158/1078-0432.CCR-11-2509.
[2] X. Wu, S. Xiao, M. Zhang, L. Yang, J. Zhong, B. Li, F. Li, X. Xia, X. Li, H. Zhou, D. Liu, N. Huang, X. Yang, F. Xiao, N. Zhang, A novel protein encoded by circular SMO RNA is essential for Hedgehog signaling activation and glioblastoma tumorigenicity, Genome Biol 22 (2021) 33. 10.1186/s13059-020-02250-6.