3月25日，Theranostics发表了由郑州大学附属第一医院孙振强，刘金波和河南省医药科学研究院汲振余为共同通讯作者的文章，报道发现结肠癌中circ1662表达升高，通过结合YAP1调控细胞迁移侵袭，circ1662的生成受到METTL3介导的侧翼内含子m6A修饰调控（[1]）。
如何找出circ1662 分子？
作者从6对结肠癌与癌旁组织的测序数据中分析差异的mRNA基因，其中与细胞连接（GO：0030054，Cell Junction）相关的mRNA有57个，其中包括YAP1。在测序数据中基于Pearson相关性分析，共有88个差异的circRNA与YAP1变化趋势相关，这些circRNA的母基因也是细胞连接基因集（GO：0030054）的有5个，它们中差异最大的是circ1662。
circ1662由YAP1基因的外显子构成，RNase R，背靠背引物，放线菌素D实验证明了circ1662是环状RNA分子。在结肠癌标本群中通过原位杂交检测，H-Score分析结果作为表达量的依据。结果显示，70.37%（38/54）的结肠癌中circ1662表达升高。高表达circ1662的患者预后更差。
图1 circ1662的发现与鉴定 （[1]）
circ1662促进结肠癌细胞转移侵袭和EMT
HCT116和SW480细胞中设计circ1662的siRNA和过表达载体，分析干扰或过表达circ1662后细胞迁移侵袭的变化情况。结果表明circ1662具有促进细胞迁移侵袭的能力。干扰circ1662后抑制EMT，而过表达后促进EMT。尾静脉注射稳定过表达circ1662的细胞显著促进肺转移灶数目。免疫组化检测表明过表达circ1662能促进EMT。
图2 circ1662 促进结肠癌细胞转移侵袭和EMT （[1]）
circ1662通过促进YAP1核定位，促进细胞转移侵袭
原位杂交和胞质-核组分分离结果显示circ1662既可以定位在细胞质中，也可以定位在细胞核中。YAP1也是胞质和核中均有定位。catRAPID工具分析显示，circ1662具有结合YAP1的功能。anti-YAP1的RIP-qPCR证明了YAP1可以与circ1662相互作用。有趣的是，作者发现过表达circ1662后，YAP1的核定位增加，与此同时，YAP1的S127磷酸化下降 。进一步说明circ1662具有结合并促进YAP1核定位的功能。过表达circ1662的同时干扰YAP1能有效抑制单独过表达circ1662后的效应，表现为细胞转移侵袭能力的降低，恢复到对照组的水平。说明YAP1是circ1662促进细胞转移侵袭的关键因素。EMT指标也发生对应的变化，过表达circ1662促进E-Cadherin降低，促进EMT，而过表达circ1662的同时干扰YAP1，相关的变化消失。
图3 circ1662结合并促进YAP1核定位，促进转移侵袭 （[1]）
circ1662通过YAP1抑制SMAD3的表达
在6对结肠癌与癌旁组织的测序数据中，作者分析了与circ1662和YAP1相关的KEGG通路。结果表明胰岛素，TGF-β，HIF-1，FoxO，MAPK和Rap1通路富集较显著。通过设计干扰circ1662后qPCR检测这些通路相关的10个最核心的基因，找出与circ1662有关的下游基因。结果表明，干扰circ1662后HK2, RELA和SOCS3显著下调，而SMAD3显著上调。过表达circ1662后，RELA和SMAD3表达下调，而同时干扰YAP1后这些基因都上调。因此作者选择SMAD3作为circ1662通过YAP1调控的下游基因。进一步实验结果表明干扰YAP1可明显促进SMAD3的表达水平。免疫荧光检测也证明了这一现象。过表达circ1662的小鼠肿瘤标本中，免疫组化结果显示过表达circ1662能抑制SMAD3的表达水平。细胞实验显示，干扰circ1662后细胞转移侵袭能力下降，而同步干扰SMAD3则恢复到对照组水平。
图4 circ1662通过YAP1调控SMAD3，促进细胞转移侵袭 （[1]）
METTL3介导circ1662侧翼内含子m6A修饰和circRNA生成
基因组序列分析显示，circ1662的上游和下游侧翼内含子中的SINE元件，上游内含子有一个MIR元件，下游内含子有两个Alu元件，并未构成显著的反向互补作用。因此作者认为circ1662可能不是通过这些经典的侧翼内含子的反向互补元件介导成环的。文献报道m6A修饰参与了RNA前体的剪切加工作用，是否m6A参与了circ1662的生成？meRIP-qPCR显示在circ1662的上游和下游侧翼内含子中存在m6A修饰。Blast分析上下游序列的互补性，发现了10个短的反向互补序列位点。分段设计引物，分析是否具有m6A修饰，结果显示，上游内含子区的一些区段存在显著的m6A修饰富集。测序数据中分析与circ1662表达相关的RNA甲基化酶，其中包括了METTL3。Anti-METTL3 RIP实验证明，circ1662上下游侧翼内含子中携带m6A的一些区段可被有效富集，说明METTL3介道了这些位点的m6A甲基化。进一步，过表达METTL3后，上述m6A位点的修饰程度有所升高。并且，过表达METTL3可显著提高circ1662的表达水平。
图5 METTL3介导circ1662侧翼内含子m6A修饰，促进circRNA生成（[1]）
METTL3通过circ1662/YAP1/SMAD3途径促进结肠癌迁移侵袭
上述的研究证明了结肠癌中circ1662/YAP1/SMAD3轴调控迁移侵袭作用，METTL3是否对该信号轴有调控作用，并最终促进细胞的迁移侵袭？为此，作者设计过表达和干扰METTL3 的体系，分析分别干扰circ1662，干扰YAP1对细胞迁移侵袭的影响。同时设计分析了干扰METTL3后过表达circ1662后circ1662及SMAD3的表达情况，细胞迁移侵袭的变化情况。结果表明，METTL3通过促进circ1662的生成，正向促进circ1662/YAP1/SMAD3轴，并最终促进细胞的迁移侵袭能力。动物实验也证明，干扰METTL3后过表达circ1662可增加肺转移灶的数目。免疫组化显示，干扰METTL3后过表达circ1662可促进YAP1的表达，降低SMAD3表达，抑制E-Cadherin表达，促进EMT。
图6 METTL3通过circ1662/YAP1/SMAD3途径促进结肠癌迁移侵袭 （[1]）
临床标本分析METTL3，circ1662，YAP1和SMAD3的表达相关性
最后作者在结肠癌组织芯片中分析了METTL3，circ1662，YAP1和SMAD3的表达相关性。结果显示，高表达circ1662的标本METTL3和YAP1都表达较高。在AJCC III-IV级标本中YAP1表达与circ1662正相关，但在I-II级标本中表达相关性不强。GEO数据显示，YAP1表达与SMAD3负相关。Dukes C/D肠癌中YAP1与SMAD3负相关。CDH1的表达与YAP1负相关而与SMAD3正相关。这些临床表达相关性分析结果验证了本文的机制。
图7 临床标本分析METTL3，circ1662，YAP1和SMAD3的表达相关性 （[1]）
circ1662作用机制汇总
肠癌中METTL3通过促进circ1662侧翼内含子的m6A修饰促进circ1662的生成表达，circ1662结合YAP1，抑制其磷酸化并促进其入核，YAP1入核后 抑制SMAD3的活性，抑制E-Cadherin的表达，进而提高了EMT和细胞迁移侵袭能力。
图8 结肠癌中circ1662作用机制 （[1]）
本文的机制证明了侧翼内含子的m6A修饰可以促进circRNA的生成。circ1662通过与YAP1结合发挥功能，对circRNA机制研究有很好的借鉴价值。
参考文献：
1. Chen C, Yuan W, Zhou Q, Shao B, Guo Y, Wang W, Yang S, Guo Y, Zhao L, Dang Q, Yang X, Wang G, Kang Q, Ji Z, Liu J, Sun Z. N6-methyladenosine-induced circ1662 promotes metastasis of colorectal cancer by accelerating YAP1 nuclear localization. Theranostics 2021; 11(9):4298-4315. doi:10.7150/thno.51342.