4月9日，Molecular Cancer杂志在线发表了南京医科大学附属第一医院徐泽宽和王林俊为共同通讯作者的文章，报道circMAPK1可以编码多肽，在胃癌中通过抑制MAPK1的功能，发挥抑癌作用。
circMAPK1的发现与鉴定
MAPK通路在肿瘤发生发展中发挥重要作用，作者通过circBase检索了MAPK通路相关的基因来源circRNA，其中MAPK1基因来源的3个circRNA进行了胃癌标本的QPCR验证，结果表明MAPK1的2-4外显子构成的circRNA（hsa_circ_0004872）在癌组织中显著下调，本文中将该circRNA命名为circMAPK1。在线数据GSE100170和GSE1211445也验证了circMAPK1在胃癌中下调。细胞株QPCR，背靠背引物，放线菌素D实验，RNase R消化实验，胞质-核分离实验及FISH实验鉴定了circMAPK1的基本信息，circMAPK1主要定位在细胞质中。最后在80对胃癌与癌旁组织的检测中表明胃癌组织中circMAPK1显著下调，circMAPK1表达低的组临床生存更差。
图1 circMAPK1的鉴定 （[1]）
circMAPK1抑制细胞增殖和迁移侵袭
设计circMAPK1的干扰和过表达实验，分析对细胞增殖，迁移侵袭的影响。结果显示，circMAPK1具有抑制细胞增殖和迁移侵袭的作用。细胞周期分析显示，干扰circMAPK1后G0/G1期的细胞比例降低，而过表达circMAPK1后G0/G1期的比例升高。
图2 circMAPK1抑制细胞增殖和迁移侵袭（[1]）
circMAPK1抑制肿瘤生长和肺转移
裸鼠皮下成瘤实验显示，干扰circMAPK1可促进肿瘤生长，而过表达circMAPK1则抑制肿瘤生长。Ki-67免疫组化表明circMAPK1抑制肿瘤生长。活体成像实验也证明了这一结论。小鼠处死后肺组织切片显示，干扰circMAPK1后肺转移增强，而过表达circMAPK1则降低肺转移效率。
图3 circMAPK1抑制肿瘤生长和肺转移（[1]）
circMAPK1可编码109aa的多肽
circRNADb预测显示，circMAPK1有跨过接口位点的ORF，也有一段序列符合IRES特征（274-327）。该段的野生型和突变型序列通过双荧光素酶报告基因检测显示，野生型序列可显著增强下游荧光素酶的表达，突变型没有这一功能。说明这段序列是IRES元件。过表达IRES野生型和突变型的circMAPK1后跑胶，分析13kD左右的差异条带，质谱检测表明存在携带circMAPK1翻译产物circMAPK1-109aa特有的LCL末端肽段的肽段指纹峰。NBP1-87943抗体专一性识别MAPK1的102-128aa区段，这一区段也恰好是circMAPK1-109aa的序列覆盖的区段，因此可以利用这一抗体通过WB检测13kD位置的条带，结果显示，过表达野生型circMAPK1在该位置有明显的条带，但过表达IRES序列突变的载体没有这个条带。利用该抗体，在肿瘤标本和细胞系中进行了WB检测，结果显示，癌组织中该位置的条带显著低于癌旁组织，生存分析表明circMAPK1-109aa低表达的胃癌患者预后更差。circMAPK1-109aa融合Flag抗体进行免疫荧光检测表明，circMAPK1-109aa主要定位于细胞质中。
图4 circMAPK1翻译产物circMAPK1-109aa的分析鉴定（[1]）
circMAPK1-109aa具有抑癌作用
circMAPK1的抑癌作用是RNA分子的作用还是翻译产物的作用呢？为分析这个问题，作者构建了circMAPK1-109aa ORF中起始密码子的突变载体，与野生型，IRES突变型载体一起分析对细胞增殖和迁移侵袭的影响。结果表明，过表达野生型circMAPK1具有显著的抑制增殖和迁移侵袭的作用，而突变IRES或ATG起始密码子都不再有抑癌功能。
图5 circMAPK1通过circMAPK1-109aa发挥生物学功能（[1]）
进一步在干扰circMAPK1的同时单独过表达circMAPK1-109aa的线性序列，分析对细胞增殖和迁移侵袭的影响。结果表明，单独过表达circMAPK1-109aa就可以显著的抑制细胞增殖和迁移侵袭。
图6 circMAPK1-109aa单独就有抑癌作用（[1]）
circMAPK1-109aa通过竞争性结合MEK1，抑制MAPK1的磷酸化
为分析circMAPK1-109aa的功能，作者在过表达Flag-circMAPK1-109aa的细胞中通过CoIP捕获蛋白，蛋白质组学质谱鉴定，结果表明MEK1是捕获丰度最高的互作蛋白。反向IP验证了circMAPK1-109aa与MEK1的相互作用。免疫荧光共定位分析也表明两者存在共定位。胃癌细胞中干扰circMAPK1，anti-MEK1的抗体进行CoIP实验，结果显示，对照组中MEK1可以捕获circMAPK1-109aa，但MAPK1的捕获丰度较低，但干扰circMAPK1后，MAPK1的捕获效率提高。IRES突变体实验也得到类似的结果。过表达circMAPK1-109aa可显著增加MEK1富集circMAPK1-109aa的效率，但过表达IRES突变的circMAPK1不会出现这一变化。针对MAPK通路下游分子的磷酸化状态WB检测显示，circMAPK1-109aa具有竞争性结合MEK1的功能，结合后抑制MAPK1的有效结合和被MEK1磷酸化。
图7 circMAPK1-109aa通过竞争性结合MEK，抑制MAPK1的磷酸化（[1]）
circMAPK1-109aa调控MAPK通路
PD0325901是MAPK通路的抑制剂，可抑制MAPK1的磷酸化。单独添加PD0325901及同步干扰circMAPK1分析表明，单独添加PD0325901并不影响circMAPK1-109aa的表达，但可以显著抑制MAPK通路激活，并进一步抑制细胞增殖，克隆形成和迁移侵袭。C16-PAF是MAPK通路的激活物，添加C16-PAF可显著激活MAPK通路，但同步过表达circMAPK1则明显降低C16-PAF对MAPK通路的激活作用。
图8 circMAPK1-109aa调控MAPK通路（[1]）
参考文献：
1. Jiang T, Xia Y, Lv J, Li B, Li Y, Wang S, Xuan Z, Xie L, Qiu S, He Z, Wang L, Xu Z. A novel protein encoded by circMAPK1 inhibits progression of gastric cancer by suppressing activation of MAPK signaling. Mol Cancer. 2021 Apr 9;20(1):66. doi: 10.1186/s12943-021-01358-y. PMID: 33836754.