4月15日，Molecular Cancer杂志在线发表了华中科技大学蒋国松教授和章小平教授为共同通讯作者的文章，报道膀胱癌中circPTPRA可结合IGF2BP1蛋白，抑制其结合下游m6A修饰的mRNA，促进Myc，FSCN1等mRNA的降解，最终发挥抑癌作用。
IGF2BP1是RNA m6A修饰的Reader蛋白之一，此前关于IGF2BP1在膀胱癌中的作用研究比较有限，并且膀胱癌中circRNA是否调控IGF2BP1的功能还不清楚。本文基于这一科学问题，通过IGF2BP1 RIP产物测序分析到IGF2BP1可结合circPTPRA，进一步分析表明circPTPRA可以结合并抑制IGF2BP1对下游m6A修饰靶分子的结合，促进下游mRNA的降解，最终发挥抑癌作用。
IGF2BP1在膀胱癌中表达升高，促进增殖和迁移侵袭
TCGA数据显示，IGF2BP1在高等级的膀胱癌中表达显著升高，且高表达IGF2BP1预后更差。作者收取了64例膀胱癌标本，QPCR检测结果显示癌组织中IGF2BP1表达升高，高表达IGF2BP1的患者预后更差。病人标本WB检测也验证了IGF2BP1在癌组织中表达升高。膀胱癌细胞系中分别构建稳定过表达和Cas-9敲除IGF2BP1的细胞系，细胞周期分析显示，过表达IGF2BP1可显著降低G0/G1期的比率，而敲除IGF2BP1则增加G0/G1期的比率。迁移侵袭实验表明过表达IGF2BP1促进迁移侵袭，而敲除IGF2BP1则抑制迁移侵袭。体内成瘤后活体成像实验表明，敲除IGF2BP1可显著抑制肿瘤生长和肺转移。
图1 膀胱癌中IGF2BP1表达升高，促进增殖和迁移侵袭（[1]）
IGF2BP1结合circPTPRA
为分析在膀胱癌中IGF2BP1结合的circRNA，作者通过RIP后做RNA seq的方案进行捕获分析。本次实验的结果与GSE97239比较后，发现有两种circRNA都被有效捕获：circCPTPRA和circSMARCA5。在稳定过表达IGF2BP1和敲除IGF2BP1的细胞中anti- IGF2BP1 RIP产物进行QPCR检测，结果表明，circCPTPRA会伴随着IGF2BP1的变化而同步变化，而circSMARCA5没有显著的改变，说明后者可能是非特异性的富集产物。因此，作者后面聚焦在分析和验证IGF2BP1与circCPTPRA的结合。RNA pull-down实验反向验证了circCPTPRA与IGF2BP1的相互作用。过表达或 干扰circCPTPRA后，RNA pull-down捕获IGF2BP1的效率同步变化。FISH与免疫荧光实验也证明circCPTPRA与IGF2BP1共定位。
图2 IGF2BP1结合circCPTPRA（[1]）
过表达circCPTPRA抵消IGF2BP1的促癌作用
体外细胞迁移侵袭实验表明过表达circCPTPRA显著抑制细胞迁移侵袭，体内活体成像实验显示，过表达circCPTPRA显著抑制肺转移，并延长生存期。分别单独或共表达circCPTPRA及IGF2BP1后分析迁移侵袭，表明单独过表达IGF2BP1促进迁移侵袭，单独过表达circCPTPRA则抑制迁移侵袭，而circCPTPRA及IGF2BP1共表达后，迁移侵袭状态恢复至对照组水平。细胞周期检测实验也得到类似的结论，单独过表达IGF2BP1降低G0/G1比例，单独过表达circCPTPRA则增加G0/G1比例，而circCPTPRA及IGF2BP1共表达后，G0/G1比例恢复至对照组水平。体内成瘤和活体成像分析也得到相似的结果。
图3过表达circCPTPRA抵消IGF2BP1的促癌作用（[1]）
circCPTPRA通过与IGF2BP1结合，抑制Myc和FSCN1表达
为分析circCPTPRA结合IGF2BP1调控的下游基因，作者在稳定过表达circCPTPRA的细胞中分析了转录组的情况，结果显示，在EJ细胞和T24T细胞的数据中有三种mRNA都是显著下调的，包括FSCN1，Myc和HSPA6。过表达circCPTPRA的EJ细胞和T24T细胞中Western检测表明FSCN1和Myc均有显著的下调，而HSPA6没有明显变化。QPCR进一步验证了这一变化。Rescue实验显示，单独过表达IGF2BP1显著促进FSCN1和Myc的表达，单独过表达circCPTPRA则抑制抑制FSCN1和Myc的表达，而circCPTPRA及IGF2BP1共表达后，FSCN1和Myc的表达恢复到对照组状态。
图4 circCPTPRA结合IGF2BP1，抑制Myc和FSCN1表达（[1]）
circCPTPRA通过Myc和FSCN1调控细胞增殖和迁移侵袭
过表达circCPTPRA后分别过表达Myc和FSCN1，分析细胞迁移侵袭和细胞周期的情况。结果表明，单独过表达circCPTPRA抑制细胞迁移侵袭，增加G0/G1期比例，而分别单独过表达Myc和FSCN1均促进迁移侵袭，降低G0/G1期比例。circCPTPRA与Myc和FSCN1分别共表达后，恢复到对照组水平。
图5 circCPTPRA通过Myc和FSCN1调控细胞增殖和迁移侵袭（[1]）
circCPTPRA结合IGF2BP1的KH结构域，抑制其有效结合带m6A的靶分子
设计IGF2BP1分段删除突变，RIP分析捕获circCPTPRA的效率，结果表明，删除KH3和KH4结构域可显著降低IGF2BP1结合circCPTPRA的效率。分析mRNA的降解速率，结果显示，过表达circCPTPRA可显著减少Myc和FSCN1的降解半衰期，说明circCPTPRA结合IGF2BP1可调控Myc和FSCN1的mRNA稳定性。内源IGF2BP1 RIP产物RNA seq测序结果表明，膀胱癌中IGF2BP1可显著结合Myc和FSCN1。RIP-QPCR实验也证明了这一结论。文献报道表明，Myc基因3’-UTR区的CRD存在高丰度的m6A修饰，IGF2BP1可以结合带m6A修饰的CRD。RIP测序分析过表达circCPTPRA前后，CRD区域富集的情况，结果表明，过表达circCPTPRA后，IGF2BP1结合CRD的效率显著降低。构建CRD野生型和突变型的荧光素酶报告系统，过表达circCPTPRA后显著抑制野生型CRD的荧光素酶表达效率，但突变型的不受影响。Rescue实验证明，单独过表达IGF2BP1可显著提高野生型CRD的荧光素酶表达效率，单独过表达circCPTPRA抑制，circCPTPRA和IGF2BP1共表达后恢复至对照水平。
图6 circCPTPRA结合IGF2BP1的KH结构域（[1]）
本文的机制模型汇总
IGF2BP1可以通过识别带m6A修饰的靶分子mRNA，维持其稳定性。circCPTPRA可以结合IGF2BP1的KH结构域，阻碍IGF2BP1结合靶分子mRNA，导致mRNA稳定性降低。
图7 circCPTPRA结合IGF2BP1的机制模型（[1]）
参考文献：
1. Xie, F., Huang, C., Liu, F. et al. CircPTPRA blocks the recognition of RNA N6-methyladenosine through interacting with IGF2BP1 to suppress bladder cancer progression. Mol Cancer 20, 68 (2021). https://doi.org/10.1186/s12943-021-01359-x