4月19日，Molecular Cancer杂志在线发表了华中科技大学蒋国松教授和章小平教授为共同通讯作者的文章，报道膀胱癌中circLIFR表达下调，可通过结合MSH2调控MutSα/ATM/p73轴，介导顺铂敏感性。前不久，该团队在Molecular Cancer杂志发表过另外一项circRNA的研究工作（推荐阅读：Molecular Cancer：circPTPRA结合并抑制m6A Reader蛋白IGF2BP1）。
circLIFR的发现与鉴定
作者团队早期研究中通过测序分析了膀胱癌与癌旁组织表达差异的circRNA分子，其中来自LIFR基因2-5的circRNA（circLIFR）在膀胱癌中表达显著降低。本文聚焦于circLIFR在膀胱癌中的功能机制研究。通过对79对膀胱癌与癌旁组织的QPCR检测，circLIFR在癌组织中显著下调。膀胱癌细胞系中circLIFR的表达也显著低于尿路上皮细胞。生存分析结果显示，低表达circLIFR的患者预后更差。Sanger测序，背靠背引物验证，RNase R消化实验鉴定了circLIFR的基本情况。半衰期分析表明circLIFR比mLIFR半衰期长，相对更稳定。胞质-核组份分离和FISH实验表明，circLIFR可以同时在胞质和核中定位。
图1 circLIFR在膀胱癌中表达与鉴定（[1]）
circLIFR与MSH2相互作用
通过RNA Pull-down后质谱分析，作者发现circLIFR可以与MSH2相互作用。Pull-down后WB检测及anti-MSH2 RIP检测证明了两者的相互作用。FISH与免疫荧光共定位分析也证明了两者在膀胱癌细胞中存在共定位。catPAPID预测结果表明circLIFR可以结合 MSH2。基于预测的结果，构建多种MSH2截短型突变，分析不同位点结合circLIFR的效率，结果显示，MSH2的ATPase结构域是结合circLIFR的位点。
图2 circLIFR结合MSH2（[1]）
膀胱癌中MSH2和circLIFR介导顺铂敏感性
文献报道膀胱癌中敲除MSH2可提高顺铂耐药性。TCGA数据中分析MSH2相关基因集，结果显示MSH2与DNA修复和凋亡密切相关。膀胱癌细胞中干扰MSH2可显著降低顺铂诱导的细胞凋亡比例。与此同时，干扰circLIFR也可提高膀胱癌细胞的耐药性，降低顺铂诱导细胞凋亡的比例。过表达circLIFR则提高顺铂敏感性，增加细胞凋亡比例。
图3 膀胱癌中MSH2和circLIFR介导顺铂敏感性（[1]）
MSH2与circLIFR协同调控膀胱癌顺铂敏感性
MSH2与circLIFR单独均具有促进膀胱癌顺铂敏感性的作用，那么两者是否有协同作用呢？分析显示，在稳定过表达circLIFR的细胞中干扰MSH2，顺铂诱导的细胞凋亡比例显著降低。而稳定表达MSH2的细胞中干扰circLIFR也可以降低顺铂诱导的凋亡。说明膀胱癌中，MSH2和circLIFR协同调控了顺铂的药物敏感性。
图4 MSH2与circLIFR协同调控膀胱癌顺铂敏感性（[1]）
MSH2/circLIFR复合物通过MutSα/ATM-p73调控顺铂敏感性
过表达circLIFR对MSH2的mRNA和蛋白没有明显改变。文献报道表明，MSH2可通过与MSH6，MSH3互作形成MutSα，MutSβ复合体，并与ATM结合，调控DNA损伤修复。为分析circLIFR是否与该复合体有关，作者通过CoIP进行分析。结果表明，膀胱癌细胞中MSH2可与MSH6，MSH3及ATM形成稳定的复合物。ATM主要与MutSα结合，但不结合MutSβ。过表达circLIFR促进MSH2与MSH6的相互作用，但干扰MSH2后该互作减弱。过表达circLIFR后，MSH2与ATM的结合增强。顺铂处理后ATM磷酸化升高，p73表达升高，但干扰MSH2后这一现象消失，干扰circLIFR也有相似的结果。单独过表达MSH2也能显著促进ATM的磷酸化和p73的表达，与此同时干扰circLIFR能部分减弱这些表型。circLIFR过表达可促进ATM磷酸化和p73表达，但同步干扰MSH2后，该现象不再出现。过表达MSH2后顺铂处理可显著增加凋亡比例，但同步干扰p73后凋亡比例则显著降低。
图5 MSH2/circLIFR复合物通过MutSα/ATM-p73调控顺铂敏感性（[1]）
体内分析MSH2/circLIFR与膀胱癌顺铂敏感性
稳定过表达circLIFR的膀胱癌细胞构建裸鼠皮下成瘤模型，比较顺铂处理对肿瘤生长的影响。结果显示，顺铂处理后，过表达circLIFR的膀胱癌成瘤速度显著下降。原位移植瘤模型也得到相似的结果。临床中分离同时低表达circLIFR和MSH2以及同事高表达两种分子的标本，构建PDX模型，分析顺铂处理对于两种临床标本PDX成瘤速度的影响。结果显示，circLIFR和MSH2都低的PDX模型用顺铂处理前后，肿瘤生长速度没有明显的差异，而circLIFR和MSH2都高的患者PDX模型经过顺铂处理则显著抑制肿瘤生长。circLIFR和MSH2都高的患者瘤组织经过顺铂处理后，免疫组化染色表明ATM磷酸化和p73的表达均升高。
图6体内分析MSH2/circLIFR与膀胱癌顺铂敏感性（[1]）
circLIFR /MSH2复合物调控膀胱癌顺铂敏感性的机制
circLIFR由LIFR基因的2-5外显子反向拼接形成，在胞质和核中均有分布。在细胞核中，circLIFR可以结合MSH2，促进后者与MSH6的结合，并进一步促进ATM磷酸化和p73的表达，增加顺铂敏感性。circLIFR在膀胱癌中表达下调。
图7 circLIFR机制模型（[1]）
参考文献：
1. Zhang, H., Xiao, X., Wei, W. et al. CircLIFR synergizes with MSH2 to attenuate chemoresistance via MutSα/ATM-p73 axis in bladder cancer. Mol Cancer 20, 70 (2021). https://doi.org/10.1186/s12943-021-01360-4