5月10日，Theranostics在线发表了大连医科大学附属第二医院汪洋教授为通讯作者的文章，报道人工设计的ECRRs蛋白可以特异性促进靶分子circRNA的生成，实现了细胞内基于人工设计体系促进内源circRNA生成的重要技术进展。
ECRRs蛋白设计
ECRRs蛋白（engineering circRNA regulators）由两部分构成：特异性识别靶RNA序列的PUF串联结构域和可二聚化的结构域。两部分结合，可以实现circRNA侧翼序列的强制性拉进，最终促进circRNA生成。PUF结构域（human Pumilio1）是一类可以专一性识别RNA单碱基的蛋白结构，非常类似于曾在基因组DNA编辑中使用的TALEN或ZFN模块。目前PUF结构域最多可以实现8个PUF模块的串联，识别8nt的序列。
ECRRs设计与报告基因验证
为验证ECRRs体系是否可有效促进circRNA生成，首先从报告基因体系开始验证。文中采用了两种报告基因体系，第一种是GFP序列反向成环的报告基因体系，就是将GFP序列拆分后N端设计在序列下游，C端设计在序列上游，如果可以准确成环，就可以通过环化位点连接后组合形成完整的GFP序列。为了分析ECRRs的效率，作者将常规的circRNA过表达载体体系作为阳性对照（circGFP-SL），另外设计了不带反向成环序列的载体（circGFP-NSL），在circGFP-NSL载体上分析ECRRs蛋白是否可以促进其成环。circGFP-NSL载体中侧翼内含子序列均携带GGGCUGCA序列，作为ECRRs的靶向序列元件，可以使用同一PUF序列模块。为分析不同RBP二聚化的效果，作者设计了多种RBP与PUF融合，包括ZBTB18，PRKAR1A，hnRNP A1，CASTOR1和QKI。验证实验表明，circGFP-SL在293T细胞中可以有效成环，GFP蛋白可以顺利表达出来，circGFP-NSL成环效率明显较低。但分别转染多种ECRRs后，circGFP-NSL载体成环效率升高，表现为GFP总体表达显著升高，GFP阳性的细胞比例升高。说明ERCCs的设计思路具有显著促进circRNA成环的功能。
理论上，质粒表达过程中会有一定的比例出现越过转录终止位点的情况，最终导致转录产生包含质粒完整一圈甚至多圈序列的产物，由于载体中GFP序列侧翼是内含子序列，有完整的RNA剪接相关的元件，所以有可能会产生非环状的副产物，但依然能拼接出GFP完整序列的假阳性信号。为解决这一问题，作者设计了将质粒酶切后线性化的对照，这样能避免上述的转录通读产物的干扰。结果表明线性化后的质粒也能表达出GFP，因此可以进一步确认该结果是通过成环实现的。
为证明所选择的可二聚化的蛋白在细胞内具有二聚化的能力，作者设计了分别用Flag和HA标签融合各种RBP，然后分别共表达同一RBP不同标签的质粒，CoIP进行验证。结果显示，Flag- ZBTB18的CoIP产物也可以捕捉到HA- ZBTB18，其他几种RBP也有相同的结果。说明这些RBP在胞内具有二聚化的能力。
图1 ERCCs设计与报告基因验证（[1]）
ERCCs二聚化结构域的优化
上述实验是将PUF模块与完整的RBP融合构建ERCCs蛋白，其中RBP的核心作用是实现二聚化，那么能否只将其中介导二聚化的结构域跟PUF融合，构建ERCCs蛋白呢？为此，作者选择了6种具有二聚化作用的结构域进行分析，包括ATL1的GTPase结构域，ZBTB18的BTB结构域，ITSN的DH结构域，PKD1的47-178aa区域，PRKAR1A的1-136aa区域，hnRNPA1的UP1结构域。分别将这些二聚化结构域与PUF模块融合，用上述的报告载体验证。结果表明，这些二聚化结构域也能有效的介导circGFP-NSL成环，GFP表达信号和GFP阳性细胞比例都有显著升高。CoIP实验也证明了这些二聚化结构域可以有效二聚化。
图2 ERCCs二聚化结构域的优化（[1]）
ERCCs促进成环的时间与剂量效应分析
上述结果证明ERCCs蛋白可以促进circGFP-NSL成环，这一效应的时间和剂量作用情况怎样的呢？为此，作者选择了四种ERCCs（PUF-ZBTB18，PUF-BTB，PUF-GTPase和PUF-UP1）分析这些载体在多个时间点样品中GFP表达量。结果显示，随着时间的延长，各种ERCCs促进GFP表达的效应存在逐渐递增的趋势，到达峰值后逐渐下降。不同的ERCCs时间梯度变化的曲线有所不同。
剂量效应方面，作者将固定量的circGFP-NSL质粒与不同剂量比例的四种ERCCs分别混合后转染。分析GFP 的表达效率。结果显示，各种ERCCs促进circGFP-NSL成环的效率随着ERCCs比例增加而递增。
图3 ERCCs促进成环的时间与剂量效应分析（[1]）
成环序列上下游不同PUF模块对ERCCs促进成环的影响分析
上述分析采用的circGFP-NSL报告载体的侧翼成环序列携带了相同的PUF靶向序列，因此只需要转染一个ERCCs分子就可以实现上游和下游成环序列的靶向，在基因组中，成环外显子侧翼序列并不能有效的符合这一条件，如果能将成环序列上游和下游的PUF靶向序列分别设计，通过共转染两个ERCC蛋白是否也可以促进成环呢？为验证这一设想，作者引入了另一种报告载体，circScreen。该报告系统可以在成环的产物表达GFP，在线性产物表达RFP，可以通过定量分析GFP和RFP的比例实现成环效率的分析。
作者设计了靶向上游成环元件的ERCC（PUF-L-GTPase）和下游成环元件的ERCC（PUF-R-GTPase），两者的PUF模块分别靶向circScreen载体中GFP上游的侧内含子区域和IRES下游的内含子区域，如果该ERCC能够促进成环，将有效促进GFP信号。WB分析表明，共表达PUF-L-GTPase和PUF-R-GTPase可显著促进GFP表达，但单独表达其中一个都不能有效提高GFP表达效率。剂量效应分析也证明了这一现象。除了GTPase二聚化结构域，BTB结构域也有相似的结果。
这一系列的验证分析表明，作者构思的ERCCs促进circRNA生成的设想是完全可行的，PUF模块可以根据需要灵活设计靶向序列，上游和下游可以是完全不同的PUF靶向序列，只要两者共转染就可以达到目的。ERCCs的二聚化结构域可以是RBP或者其他的具有二聚化功能的结构域即可。
图4 ERCCs的PUF序列分析（[1]）
ERCCs促进内源circRNA生成
最后，为验证ERCCs的设计能否有效促进内源基因成环，作者分析了两个circRNA进行验证：来自Cul2基因7-11外显子的的circ10720和BIRC6基因2-8外显子的circBIRC6。分别在两个circRNA成环的上下游侧翼内含子设计靶向PUF序列模块，二聚化结构域分别选择GTPase和BTB。结果表明，ERCCs能够显著促进两种内源circRNA的生成，但不影响对应mRNA的表达。在两个circRNA的实验中PUF-GTPase促进成环的效率更高一些。
图5 ERCCs促进内源circRNA生成（[1]）
本文提出并验证的ERCCs可显著促进成环，未来可实现特异性促进内源circRNA的表达，是circRNA研究的一个强有力的工具。
参考文献：
1. Yangfan Qi, Wei Han, Dan Chen, Jinyao Zhao, Lu Bai, Fang Huang, Zhenwei Dai, Gang Li, Chaoqun Chen, Wenjing Zhang, Jinrui Zhang, Bilian Jin, Yang Wang. Theranostics 2021; doi:10.7150/thno.56990; in press