5月1日，Advanced Science杂志在线发表了复旦大学肿瘤医院黄胜林教授，何祥火教授和郭维杰为共同通讯作者的文章，报道在肝癌中发现ARHGAP35来源circRNA（circARHGAP35）可以由HNRNPL介导生成，可翻译1289aa的蛋白，功能与ARHGAP35相反，具有促癌的作用。
HCC中circARHGAP35表达升高而ARHGAP35的 mRNA表达下调
通过对12对HCC癌与癌旁标本的高通量测序，作者分析到了来自9799个基因的42959种circRNA分子，其中177种circRNA显著下调，16种circRNA显著上调。其这些显著变化的circRNA绝大部分的变化状态不依赖于母基因的变化。其中来自ARHGAP35基因2-3外显子的circRNA（circARHGAP35）是显著升高的circRNA分子之一，而ARHGAP35的mRNA在HCC癌组织中表达下调。QPCR检测显示外显子2-3形成的circARHGAP35是ARHGAP35基因来源的circRNA中表达最显著的分子。FISH杂交实验和胞质-核分离后QPCR检测表明circARHGAP35主要定位于细胞质中。RNase R实验，Northern杂交和放线菌素D分析验证了circARHGAP35是环状RNA的基本特征。
图1 HCC中circARHGAP35表达显著升高（[1]）
HCC中circARHGAP35促癌
研究表明ARHGAP35具有抑癌作用，在HCC中表达下调。但测序结果中circARHGAP35是表达上调的，那么circARHGAP35在HCC中的作用是怎样的？为此，作者设计了circARHGAP35的siRNA（si- circARHGAP35），同步设计了靶向ARHGAP35外显子2和3之外的序列的siRNA对照（si- ARHGAP35），外显子2和3序列中的siRNA对照（si-both）。分别分析这些siRNA对HCC细胞增殖和迁移侵袭及体内成瘤能力的影响。结果表明，circARHGAP35在HCC中具有促癌的作用，而circARHGAP35的母基因ARHGAP35具有抑癌的作用。
图2 HCC中circARHGAP35具有促癌功能 （[1]）
circARHGAP35可翻译蛋白
刚开始，作者假设circARHGAP35可能通过与胞内的蛋白相互作用发挥功能。通过构建MS2融合的过表达载体，pull-down分析了互作蛋白，结果显示，翻译起始因子EIF3I和EIF2S1可以被捕获，RIP实验也证明了这一相互作用。该结果暗示circARHGAP35或许可以能被翻译。序列分析表明，circARHGAP35序列中包含一个跨过接口位点的3867 nt长的ORF序列，编码了一个1289aa的蛋白。通过构建Flag融合的报告载体和相关的验证对照，WB检测显示，准确成环的circARHGAP35可以被翻译出蛋白。并且利用抗ARHGAP35蛋白N端的抗体进行IP富集后蛋白质谱检测，得到了携带跨接口位点后circARHGAP35特有编码氨基酸序列的峰图，证明了circARHGAP35翻译产物在HCC细胞内源天然存在。蔗糖密度梯度离心进行polysome profiling验证，也证明了circARHGAP35倾向于结合polysome，EDTA处理后，circARHGAP35从Heavier polysome组份转变为lighter polysome。meRIP-seq分析表明circARHGAP35在起始密码子附近存在m6A修饰位点。过表达m6A去修饰酶FTO可同步降低circARHGAP35的m6A修饰比例以及翻译产物的丰度。
图3 circARHGAP35通过m6A驱动翻译 （[1]）
circARHGAP35翻译产物具有促癌作用
为分析circARHGAP35翻译产物的功能， 作者通过构建线性表达circARHGAP35-ORF及对照进行分析。结果显示，circARHGAP35的翻译产物具有促进克隆形成和促进细胞增殖，迁移侵袭的能力。
图4 circARHGAP35翻译产物具有促癌功能（[1]）
circARHGAP35蛋白在核内与TFII-I相互作用
circARHGAP35蛋白与ARHGAP35母基因蛋白的序列在N端重合，只有C端一小段是特有的序列，circARHGAP35蛋白也有4个FF结构域，但缺少了RhoGAP结构域。Flag融合的circARHGAP35蛋白进行免疫荧光检测，发现该蛋白主要定位在核中，但母基因ARHGAP35蛋白主要定位在胞质中。ARHGAP35蛋白具有抑制RhoA的功能，但过表达circARHGAP35蛋白后并没有显著改变胞内总RhoA的活性，全长的ARHGAP35蛋白是可以显著抑制RhoA的总活性的。研究报道，FF结构域可以与TFII-I相互作用，免疫荧光共定位检测也证明circARHGAP35蛋白和TFII-I在细胞核中存在共定位。CoIP后WB检测验证了circARHGAP35蛋白与TFII-I的相互作用。细胞增殖和迁移侵袭实验表明， 单独过表达circARHGAP35蛋白可促进增殖和迁移侵袭，但同时干扰TFII-I后，该效应显著下降。说明circARHGAP35蛋白主要通过TFII-I发挥促进增殖和迁移侵袭的作用。
图5 circARHGAP35蛋白在核内与TFII-I相互作用促进增殖和迁移侵袭（[1]）
HNRNPL介导circARHGAP35的生成
为分析HCC中介导circARHGAP35生成的RBP蛋白，作者通过针对63种与RNA剪切有关的蛋白进行RNAi Screening，分析各个RBP对circARHGAP35和线性ARHGAP35表达丰度的影响，只有不显著改变线性ARHGAP35，但显著降低circARHGAP35表达比例的RBP才是特异性介导circARHGAP35生成的RBP蛋白。经过筛选实验，最终表明，只有HNRNPL符合上述筛选标准。在circARHGAP35侧翼内含子中分析潜在的HNRNPL结合位点（CA-rich elements），分析已发表的eCLIP数据分别在上游内含子1和下游内含子3中找到了两个潜在结合位点。抗HNRNPL抗体进行RIP捕获，QPCR检测显示，上游的位点1和下游的位点2是HNRNPL结合最强的位点。基于连个位点构建报告基因，干扰HNRNPL后QPCR显示可显著降低报告基因成环效率。证明了这两个位点对circARHGAP35生成的调控作用。最后。在HCC标本中可以检测到HNRNPL表达上调，并且HNRNPL的表达与circARHGAP35的表达呈正相关的关系。
图6 HCC中HNRNPL介导circARHGAP35的生成（[1]）
高表达circARHGAP35的HCC生存状况更差
最后，作者分析了HCC标本中circARHGAP35表达与临床的关系。110例HCC标本的检测显示，HCC中circARHGAP35表达显著升高，而线性ARHGAP35表达显著下降。生存分析结果显示，高表达circARHGAP35的HCC患者预后更差。
图7 circARHGAP35表达升高的HCC预后更差（[1]）
HCC中circARHGAP35作用机制汇总
HCC中，HNRNPL结合并促进ARHGAP35的第2、3外显子成环，生成circARHGAP35，circARHGAP35可通过m6A介导的翻译起始，翻译一种1289aa的蛋白，该蛋白包含了4个FF结构域，可定位到细胞核中，与TFII-I相互作用，促进细胞增殖和迁移侵袭。HCC中ARHGAP35母基因表达下调
图8 circARHGAP35机制汇总（[1]）
该工作分别利用了MS2标签融合法RNA pull-down技术，捕获了circARHGAP35的相互作用蛋白，其中包括翻译起始的因子，由此推测circARHGAP35可能具有翻译潜能，进一步通过载体验证和内源蛋白质谱检测证明了circARHGAP35在HCC中翻译一种1289aa的蛋白。还利用针对63种RNA剪切相关的RBP进行RNAi文库筛选，找出介导circARHGAP35生成的分子HNRNPL。这些技术思路对于circRNA研究有非常好的借鉴价值。
参考文献：
1. Yan Li, Bing Chen, Jingjing Zhao, Qin Li, Siyuan Chen, Tianan Guo, Yuchen Li, Hongyan Lai, Zhiao Chen, Zhiqiang Meng, Weijie Guo, Xianghuo He,and Shenglin Huang. HNRNPL Circularizes ARHGAP35 to Produce an Oncogenic Protein. Advanced Science. Doi: 10.1002/advs.202001701.