5月21日，Signal Transduction and Targeted Therapy杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的综述文章，系统汇总了人类疾病中靶向circRNA的策略和挑战。
circRNA的生成机制和主要功能
按照序列来源，circRNA可分为外显子型circRNA（exonic circRNA, ecircRNA）,外显子-内含子型circRNA（exon-intron circRNA，EIcircRNA）及内含子型circRNA（intronic circRNA， ciRNA） 。生成机制方面，可以通过侧翼内含子的反向互补元件介导生成，也可以通过RBP结合后介导，还包括套索结构（Lariat）介导形成。EIcircRNA和ciRNA往往定位与细胞核中，ecircRNA倾向于定位在胞质中。功能方面，circRNA可以通过竞争性结合miRNA，结合蛋白，直接翻译蛋白，调控翻译过程等方面发挥作用。
图1 circRNA生成与功能（[1]）
人类疾病中靶向circRNA
经过最近几年的研究，在多种人类疾病中发现了特异性变化的circRNA分子，这些circRNA分子具有作为疾病治疗靶点的潜在价值。文中系统汇总了肿瘤，心血管疾病，神经系统疾病，青光眼及其他疾病中表达差异的circRNA及作为治疗靶点的一些进展，详细信息可查阅表1或全文。
表1 人类疾病中异常表达的可作为治疗靶点的circRNA汇总（[1]）
靶向circRNA的主要技术
差异表达的circRNA在疾病的发生发展中起到了特殊的作用，因此有作为治疗靶点的潜力。概括而言，靶向circRNA的策略包括功能缺失性策略（Loss-of-Function）和功能获得性策略（Gain-of-Function）。
基于RNAi实现circRNA敲低
siRNA或shRNA介导的RNAi可以实现circRNA的敲低，已经在很多的研究中获得验证。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，AON）也可以介导circRNA的敲低，但AON往往长度比siRNA或shRNA更长，在干扰circRNA的研究中用的不多，但可以作为屏蔽circRNA与蛋白相互作用的分子发挥功能。但该策略存在易被核酸酶降解，较低的细胞靶向特异性以及非特异性脱靶效应等问题。
基于载体实现circRNA 过表达
目前有多种载体可实现circRNA的过表达，体内往往通过慢病毒或AAV载体实现circRNA的过表达。
体外合成circRNA
除了通过载体进行过表达，也可以在体外通过化学法或体外转录获得circRNA全长，然后基于Splint技术实现环化。但目前该技术体系的产物得率非常低，还存在免疫原性等问题。
图2 靶向circRNA的策略 （[1]）
基于纳米颗粒实现circRNA递送
纳米颗粒可以实现药物等分子递送至病变位点，已经实现了造影剂，药物的纳米颗粒递送。这些纳米颗粒直径有几十到几百纳米。其中脂质纳米颗粒是发展最成熟的纳米颗粒体系。脂质纳米颗粒可以携带siRNA等分子通过内吞作用进入胞内。作者的实验室还利用纳米金颗粒实现了动物模型中靶向circRNA的siRNA或AON的递送，也可以实现circRNA过表达载体的递送。
基于外泌体实现circRNA递送
除了纳米颗粒，外泌体也可以作为RNA递送的介质。外泌体可实现靶向circRNA的siRNA或过表达载体的递送。
circRNA条件性敲除/敲低
Cre-LoxP体系在动物模型中可实现组织/细胞特异性的基因敲除或过表达，在动物模型中发挥特殊的重要作用，是实现组织特异性基因改造的重要技术策略。利用各种组织/细胞特异性的Cre模式动物，可实现组织/细胞特异性的circRNA靶向干预。
CRISPR/Cas9实现circRNA敲除
一些研究表明，通过CRISPR/Cas9对介导成环的侧翼内含子序列进行基因打靶，可显著抑制circRNA的生成，并且对母基因不会产生明显的影响，因此可以构建靶向circRNA的敲除模式动物。
CRISPR/Cas13实现circRNA敲降
CRISPR/Cas13体系是特异性靶向RNA的体系，已有研究表明Cas13体系可以实现circRNA特异性的敲低，但对母基因mRNA的影响非常小，是circRNA特异性敲降的重要新技术。
图3 体内靶向circRNA递送体系（[1]）
目前靶向circRNA的主要挑战
circRNA敲低技术的脱靶效应
靶向circRNA的siRNA至少有一半的序列与母基因mRNA配对，可能存在miRNA-like的非特异性作用，这一作用或不同程度的影响细胞功能，产生非特异性效应。CRISPR/Cas13体系或许能在一定程度上降低这种效应，但目前还不十分明确。
非特异性的组织/细胞递送
一些circRNA往往在多种组织或细胞中表达，这为靶向circRNA的策略提出了挑战。常规的靶向circRNA体系可能会带来组织或细胞非特异性的毒副作用。纳米递送系统可以提高递送细胞的特异性，可能一定程度降低这种非特异性效应。另外，更特异性表达的体系也许能解决该问题。
纳米金颗粒的毒性
纳米金颗粒可以在动物模型中实现circRNA干扰或过表达载体的递送，但该体系的临床安全性还不清楚。纳米金颗粒的毒性可能与直径有关，直径越小的纳米金颗粒毒性可能越大。脂质纳米颗粒递送系统已获批应用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的siRNA靶向治疗，这或许暗示脂质体纳米递送希望有望实现circRNA的靶向治疗。
错误剪切产物
circRNA过表达载体往往产生非特异性的副产物，这些副产物会不同程度造成非特异性的副作用。体外合成的高纯度circRNA有望改善这一不足。
化学合成circRNA的免疫原性
有报道显示，体外化学合成的circRNA转染细胞后会诱导天然免疫效应通路，有潜在的免疫原性。增加m6A修饰位点能降低免疫原性。目前可以通过增加化学修饰或者包被RBP蛋白实现免疫原性的降低。
参考文献：
1. He AT, Liu J, Li F, Yang BB. Targeting circular RNAs as a therapeutic approach: current strategies and challenges. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 21;6(1):185. doi: 10.1038/s41392-021-00569-5.