6月11日，Molecular Cancer 杂志在线发表重庆医科大学陈俊霞教授为通讯作者，研究生王晓松为第一作者的文章，报道发现circACTN4在乳腺癌中高表达，并通过结合FUBP1调控myc的转录与表达，从而促进了乳腺癌的发生发展。
1. CircACTN4的鉴定，并证明USF2促进circACTN4在乳腺癌中的表达
利用微阵列分析了4对BC组织和癌旁组织中circRNA的表达特征，作者发现85个显著差异表达的circRNA，其中63个上调circRNA, 22个下调circRNA。其中circACTN4 (hsa_circ_0050900)是最异常表达的circRNA，其在乳腺癌组织中的表达是癌旁组织的10倍。通过生物信息学网站预测其来源于线性ACTN4的第2至第7个外显子的反向剪切。FISH以及核质分离实验检测其主要定位于细胞核。CircACTN4相对于线性基因，更加耐受放线菌素D和RNA酶 R消化。随后作者通过生物信息学、双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀(ChIP)实验证明转录因子USF2与ACTN4的启动子区域结合，从而促进ACTN4转录。构建USF2的过表达和干扰质粒，证明USF2可以促进线性ACTN4以及circACTN4的表达。
图1. circACTN4在乳腺癌中的验证和鉴定（[1]）
2. circACTN4在乳腺癌组织和细胞中高表达，并与临床病理特征相关
采用qRT-PCR检测80对乳腺癌组织及癌旁组织中circACTN4的表达。 数据显示，circACTN4在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，这与芯片分析的结果一致。ROC曲线评价circACTN4在乳腺癌筛查中的诊断效果： circACTN4的曲线下面积(AUC)为0.719, ROC曲线分析截止值为12.77时，诊断特异性为70%，敏感性为70。 此外，circACTN4在乳腺癌细胞(MCF-7、SK-BR-3、ZR-75-1、T-47D和TB -474)中的表达明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A。 作者又利用含有240乳腺癌组织的人类组织芯片(TMAs)来测定ISH对circACTN4的表达。通过Kaplan-Meier生存分析，circACTN4高表达的患者总生存期比circACTN4低表达的患者短。进一步分析表明circACTN4的表达与T期、N期、TNM期呈正相关。 总之，circACTN4在乳腺癌患者中可发挥致癌作用，circACTN4的高表达可预测乳腺癌患者预后不良。
图2. circACTN4在BC中表达上调，与BC患者病情进展及预后不良相关（[1]）
3. circACTN4可促进BC细胞增殖，调节BC细胞凋亡
为探讨circACTN4在BC细胞中的生物学功能，作者将circACTN4过表达质粒和靶向circACTN4的小干扰RNA转染BC细胞。 结果表明，qRT-PCR检测转染相应载体或siRNA的BC细胞中circACTN4的表达显著上调或下调，但过表达和敲除circACTN4均未影响线性转录本ACTN4的表达水平。 平板克隆、EdU和CCK-8检测显示，过表达circACTN4显著增强了BC细胞的增殖能力，而敲除circACTN4显著抑制了细胞活力。 Hoechst 33342染色显示转染si-circACTN4后，BC细胞出现明显的荧光增强、核片段增强、染色质聚集、凋亡小体等凋亡形态学特征。 采用AnnexinV/ PI染色的流式细胞术检测细胞凋亡率，结果表明敲除circACTN4可以诱导BC细胞凋亡。 最后，作者通过western blot检测凋亡相关蛋白，结果显示，与对照组相比，circACTN4下调导致caspase-3和促凋亡蛋白Bax的水平升高，Bcl-2的表达降低。
图3. circACTN4可促进BC细胞增殖，抑制BC细胞凋亡 （[1]）
4.circACTN4增加BC细胞的迁移和侵袭，并调节细胞周期进程
为了进一步评估circACTN4对BC的细胞周期进展、迁移、侵袭的影响，作者进行了过表达或敲除circACTN4，观察BC细胞的细胞周期。划痕和transwell实验表明，上调circACTN4可显著提高BC细胞的侵袭和迁移能力，下调circACTN4可显著抑制其侵袭和迁移能力。 然后，作者用western blot检测转移相关蛋白nm23-H1、MMP9、MMP2蛋白水平，结果显示MMP9、MMP2蛋白水平与circACTN4表达呈正相关，而BC细胞中过表达circACTN4后，nm23-H1蛋白水平下调。 由流式细胞仪细胞周期分析, 结果显示, 敲低circACTN4导致低水平的S期细胞周期和更高比例的 G1期细胞, 这表明circACTN4沉默，造成BC细胞周期阻滞。 western blot检测细胞周期相关蛋白的表达，作者发现敲除circACTN4后，BC细胞中CDK4、CCNE1和CCND1蛋白水平显著下调，抑制了BC细胞的细胞周期进程。
图4. circACTN4促进BC细胞的迁移、侵袭和细胞周期进程（[1]）
5.CircACTN4与FUBP1相互作用，激活MYC转录
为了探索CircACTN4的分子机制，作者进行了pull down，银染和质谱分析来检测与circACTN4结合的蛋白， 发现FUBP1在circACTN4上显著富集。随后RIP检测通过PCR和qRT-PCR进一步证实FUBP1与BC细胞内源性circACTN4结合。 FISH-IF实验显示circACTN4和FUBP1在细胞核中共定位。 但是，上调和下调circACTN4并没有改变FUBP1的表达水平，表明circACTN4没有参与FUBP1的翻译后调控。 既往研究表明，FUBP1可结合MYC启动子的FUSE区域促进MYC的表达，而FUBP1-FUSE复合物可能招募FIR抑制MYC转录。 接下来，ChIP-PCR实验证实了在BC细胞中FUBP1与MYC启动子的FUSE结合。 为了探讨FUBP1和FIR在BC中的作用，作者构建了FUBP1和FIR过表达和下调质粒。qRT-PCR和western blot结果证明FUBP1明显促进MYC在乳腺癌细胞表达水平。此外, 作者还发现，FUBP1在乳腺癌组织的表达明显高于邻近的正常组织。 Pearson相关分析显示，circACTN4的水平与BC组织中FUBP1的表达呈正相关。 此外, qRT-PCR 和 Pearson相关分析结果显示，MYC在BC组织中高度表达且与FUBP1的表达呈正相关，circACTN4与 MYC在乳腺癌中的表达正相关。此外,western blot结果表明circACTN4可以促进MYC和其下游蛋白CDK4 ,CCND2的表达。
图5.circACTN4可以与FUBP1结合，上调MYC的表达（[1]）
6.circACTN4和FIR竞争结合FUBP1
作者推测circACTN4可以与FUBP1结合，阻止FIR与FUBP1结合，促进MYC的转录和表达。 为了进一步验证所提出的假设，首先通过qRT-PCR检测FIR在乳腺癌中的表达，数据显示，与正常的组织相比，FIR在BC组织中的表达明显下调。 Pearson相关分析显示，在BC组织中FIR的表达与circACTN4、FUBP1、MYC水平呈负相关。 随后，作者探讨了circACTN4是否会影响FIR与FUBP1的结合。 用抗FUBP1抗体对MCF-7细胞进行Co-IP。 结果表明，过表达circACTN4的BC细胞共沉淀中未发现明显的FIR蛋白带，而敲除circACTN4后，western blot在沉淀产物中明显检测到FIR蛋白带。 这表明上调circACTN4显著减弱了FIR与FUBP1的结合，下调circACTN4显著增强了FUBP1与FIR的相互作用。 而一系列ChIP检测结果显示，高浓度si-circ#2转染后，FIR与FUSE的结合水平高于转染低浓度si-circ#2组。 此外，作者们发现，在BC细胞中，qRT-PCR和western blot结果显示，沉默FIR显著提高了MYC的表达，而过表达FIR则降低了MYC的水平。最后，将过表达或敲低FIR质粒与circACTN4或si-circ#2共转染后， 作者通过qRT-PCR结果发现，过表达FIR可以逆转circACTN4对MYC表达的增强作用，而敲低FIR可以抵消circACTN4下调对MYC表达的抑制作用。
图6. circACTN4阻断FUBP1与FIR的结合（[1]）
7. FIR逆转了circACTN4在BC细胞中的促肿瘤作用
为了进一步研究circACTN4是否通过circACTN4/FUBP1/MYC轴发挥生物学作用，作者在BC细胞中进行了一系列的拯救实验，分别用circACTN4或si-circ#2共转染过表达或敲低FIR质粒。 结果表明，FIR过表达可显著逆转circACTN4上调对BC细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用，而通过划痕、EdU和transwell实验，FIR下调可逆转circACTN4下调对BC细胞的抑制作用。 此外，IF实验也显示过表达和敲除FIR可以明显逆转circACTN4上调和下调对MYC表达的影响。IF实验结果表明，与癌旁组织相比，MYC在BC组织中高表达。 western blot分析显示，上调和下调FIR可以通过过表达和沉默circACTN4来抵消对MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2表达的增强和抑制作用。
图7. FIR逆转circACTN4在BC细胞中的致癌作用（[1]）
8. CircACTN4促进体内异种移植瘤的发生和转移
为评价circACTN4在体内的致瘤作用，采用皮下注射和尾静脉注射的方法在裸鼠体内建立人BC细胞肿瘤模型。 将过表达circACTN4慢病毒或circACTN4 shRNA慢病毒感染的MCF-7细胞接种给雌性裸鼠，并接种对照。 结果表明，过表达circACTN4组移植瘤的体积和重量明显大于对照组，而抑制circACTN4显著抑制了肿瘤的生长。 此外，与对照组相比，circACTN4表达上调明显增加了转移性肺结节的数量，而沉默circACTN4显著抑制了肿瘤细胞侵袭性较低的自发性肺转移。且过表达circACTN4可显著促进肿瘤血管生成，而抑制circACTN4可显著降低肿瘤微血管密度。随后，western blot结果显示，与对照组相比，过表达或沉默circACTN4组移植瘤组织中MYC蛋白水平显著升高或降低。 随后，为了进一步观察circACTN4在体内对肿瘤转移的影响，我们将稳定过表达circACTN4和沉默circACTN4的MCF-7细胞静脉注射到BALB/c裸小鼠的尾静脉中。 通过生物荧光成像技术对肿瘤体内转移进行检测， 结果显示，circACTN4过表达组检测到更强、更多的生物荧光信号，而circACTN4沉默组的小鼠与对照组相比，生物荧光转移的数量更少。 此外，与对照组相比，过表达circACTN4的小鼠总生存率更低，肝转移更广泛。 最后，我们通过免疫组化的方法确定了circACTN4对其靶蛋白MYC、下游细胞周期相关蛋白CDK4和CCND2以及细胞增殖相关蛋白Ki67的影响。 结果显示，上调circACTN4可以增加肿瘤组织中MYC、CDK4、CCND2和Ki67的表达，而沉默circACTN4则降低了这些蛋白的表达水平。
图8. circACTN4促进BC细胞在体内的发生和转移（[1]）
综上所述，作者发现并鉴定了一种新型的环状RNA circACTN4，它在人类乳腺癌组织和细胞中表达上调，且circACTN4表达的增加与乳腺癌患者预后不良相关。此外，作者们还发现过表达circACTN4可以有效地促进BC细胞的增殖、侵袭和转移。在机制上，首先发现USF2介导的circACTN4可能直接与FUBP1结合，它们的相互作用可以阻碍FUBP1与FIR的结合，从而激活MYC的转录，促进BC的发育。研究结果表明circACTN4可能是一种新的预后生物标志物和有前途的乳腺癌治疗靶点。
参考文献：[1] Wang X, Xing L, Yang R, Chen H, Wang M, Jiang R, Zhang L, Chen J. The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Mol Cancer. 2021 Jun 11;20(1):91. doi: 10.1186/s12943-021-01383-x. PMID: 34116677.