近期，Cell Death Disease期刊在线发表了南华大学附属第一医院尹科博士的一篇题为Circular RNA AFF4 modulates osteogenic differentiation in BM-MSCs by activating SMAD1/5 pathway through miR-135a-5p/FNDC5/Irisin axis的文章，该作者首次揭示了circ_AFF4调控骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）成骨的分子机制。circ_AFF4通过与miR-135a-5p的互补结合促进了FNDC5/Irisin的表达，而Irisin与整合素αV形成分子复合物，并通过SMAD1/5通路调控骨髓间充质干细胞的成骨分化。强调了circ_AFF4能作为骨形成相关疾病治疗靶点的潜在价值，为深入了解BM-MSCs成骨谱系调控的分子机制提供了深刻的见解。
研究路线
（作者根据已有文献推测circ_AFF4能否介导骨髓间充质干细胞的成骨分化过程，并进行验证。）
1、成骨诱导后，细胞内Circ_AFF4和miR-135a-5p在骨髓间充质干细胞中差异表达
为了研究circ_AFF4和miR-135a-5p在成骨分化过程中的生物学作用，作者购买了人源BM-MSCs并对其进行鉴定。作者发现与正常培养基(NM)相比，成骨诱导培养基（OM）处理的BM-MSCs显示茜素红S(ARS)和碱性磷酸酶染色(ALP)强度明显增高并表现出高效的成骨分化能力。同时circ_AFF4在成骨分化诱导过程中显著上调，而miR-135a-5p则下调。这些结果成功证明了骨髓间充质干细胞的特性，并揭示了在成骨分化过程中circ_AFF4和miR-135a-5p差异表达。
图1骨髓间充质干细胞的特性
2、Circ_AFF4下调抑制了骨髓间充质干细胞的成骨分化
作者首先通过实验证实了circ_AFF4的存在以及其环状RNA的特性。为了进一步验证circ_AFF4的作用，作者发现沉默circ_AFF4后BM-MSCs 的ARS和ALP染色强度明显降低，表明成骨分化能力降低。然后将上述BM-MSCs在OM中培养3天后实验分析发现沉默circ_AFF4后的BM-MSCs中成骨标志物RUNX2阳性细胞的数量明显减少，此外，作者还分析了成骨标志物ALP、BMP4、RUNX2、Spp1和Colla1并观察到，沉默circ_AFF4可以在mRNA和蛋白水平上有效抑制成骨相关基因。这些数据表明，circ_AFF4可能在调节BM-MSCs成骨分化方面发挥积极作用。
图2 circ_AFF4对BM-MSCs成骨分化的调控
3、circ_AFF4通过miR-135a-5p介导骨髓间充质干细胞的成骨分化
作者使用生信分析预测circ_AFF4的潜在靶分子为miR-135a-5p。使用荧光素酶报告实验和RNA-pull down实验证实了两分子间的直接相互作用。接下来，作者发现过表达circ_AFF4可明显抑制miR-135a-5p的表达，沉默则相反。然而，有趣的是与circ_AFF4和miR-135a-5p模拟物共转染可以有效地恢复并增加miR-135a-5p的水平。随着分化的进行，miR-135a-5p不仅抑制了circ_AFF4对RUNX2蛋白（成骨标志物）的上调表达。也抑制了多种成骨标志物的mRNA和蛋白的表达水平。结果表明，circ_AFF4通过miR-135a-5p促进BM-MSCs的成骨分化。
图3 miR-135a-5P与circ_AFF4的关系
4、Circ_AFF4通过直接结合miR-135a-5p上调FNDC5/Irisin
作者使用生信分析预测miR-135a-5p的潜在下游结合靶点为FNDC5。使用荧光素酶报告实验和RNA-pull down实验证明了两分子间的直接相互作用。为了研究miR-135a-5p在成骨分化过程中对FNDC5的调控作用，作者发现抑制miR-135a-5p可提高FNDC5的表达，过表达则相反。有趣的是，作者发现过表达circ_AFF4的BM-MSCs中FNDC5 mRNA和蛋白质水平均有上调。然而，与miR-135a-5p模拟物共转染则完全消除了这种温和的上调。与FNDC5的结果类似，作者发现circ_AFF4提升了Irisin的浓度，而与miR-135a-5p模拟物共转染则抵消了这种提升。作者的发现首次证明了circ_AFF4作为miR-135a-5p的海绵促进
FNDC5/Irisin在成骨分化中的表达。
图4 circ_AFF4和FNDC5/Irisin能够调节成骨分化
5、下调FNDC5/Irisin可抑制circ_AFF4对成骨分化的促进作用
circ_AFF4和FNDC5/Irisin能否调控成骨分化，以及如何调控它？
作者发现沉默FNDC5明显降低了BM-MSCs中由过表达circ_AFF4增强的ARS和ALP染色的强度，随着分化的进行，circ_AFF4明显增加了成骨标志物ALP、BMP4、RUNX2、Spp1和Colla1在mRNA和蛋白水平的表达。然而，沉默FNDC5可以适度地抵消这种促进作用。综上所述，作者的研究结果显示，下调FNDC5/Irisin可部分抑制circ_AFF4的促进成骨分化功能。
图5 circ_AFF4和FNDC5/Irisin能够调节成骨分化
6、Irisin结合整合素αV激活SMAD1/5通路调控骨髓间充质干细胞成骨分化
有研究表明，整合素αV在骨细胞和脂肪组织中是一种Irisin受体，并参与骨重塑调控。为了探究Irisin/Integrin αV复合物在成骨分化过程中的可能机制，并回答Irisin是否是SMAD1/5的上游调控因子的问题，作者发现过表达Irisin刺激了磷酸化SMAD1/5的表达，然而，并没有改变SMAD1/5在非磷酸化构象中的表达水平。接下来，作者应用实验证实了Irisin和整合素αV是在骨髓间充质干细胞中直接结合。作者还研究了整合素αV是否参与SMAD1/5通路的调控。事实上，整合素αV下调明显降低了由Irisin过表达刺激产生的SMAD1/5表达，并导致该信号通路部分堵塞。以往的研究表明SMAD1/5的激活对成骨分化是必不可少的。与之一致的是，作者发现通过细胞透性蛋白酶体抑制剂MG132失活可以有效抑制SMAD1/5通路Irisin诱导的成骨分化。
图6 鸢尾素结合整合素αV通过激活SMAD1/5通路
7、circ_AFF4的促成骨功能依赖于SMAD1/5通路
接下来，作者试图解决circ_AFF4的促成骨功能是否也与SMAD1/5通路相关。
他们通过实验证实SMAD1/5通路是由circ_AFF4过表达激活，观察到ARS和ALP的染色强度随着circ_AFF4的上调而增加，但在MG132处理后明显下降，表明BM-MSCs成骨分化能力降低。此外，用MG132抑制SMAD1/5通路，消除了circ_AFF4对成骨标志物ALP、BMP4、RUNX2、Spp1和Colla1的促进作用，并在mRNA和蛋白水平上大幅抑制了它们的表达。这些结果证实了作者的假设circ_AFF4对BM-MSCs成骨分化的调控功能部分通过SMAD1/5途径发挥。
图7 circ_AFF4 通过SMAD1/5通路的促成骨分化
8、circ_AFF4敲低对骨形成的体内抑制
为了探索circ_AFF4在小鼠体内对骨形成的影响作用，作者通过ALP和ARS染色发现，在circ_AFF4下调的小鼠骨样本中显示出了骨细胞分化减少和钙沉积现象，表明成骨分化能力降低。作者也用其他组织学染色方法评估小鼠组织的新骨形成。H&E染色和Masson三色染色结果显示，与对照组相比，沉默 circ_AFF4明显抑制了小鼠的新骨再生。接下来，作者通过IHC染色发现沉默circ_AFF4明显抑制了RUNX2蛋白的合成。此外，与阴性对照组相比，植入沉默circ_AFF4支架的小鼠成骨标志物ALP、BMP4、RUNX2、Spp1和Colla1的mRNA和蛋白水平均明显降低。综上所述，这些数据首次提供了体内实验证据，表明过表达circ_AFF4会促进小鼠体内骨再生，沉默则抑制。
图8 circ_AFF4 对小鼠成骨分化的影响
结论
在本研究中，作者发现circ_AFF4在成骨分化诱导过程中明显增强，而其下调能够显著抑制BM-MSCs的成骨潜能。相反，miR-135a-5p的表达随着分化的进行而下降。此外，circ_AFF4通过与miR-135a-5p的互补结合促进FNDC5/Irisin的表达，而Irisin与整合素αV形成分子间复合物，并通过SMAD1/5通路调节成骨分化。作者的研究结果揭示了circ_AFF4在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的新功能，并暗示了其作为骨形成相关疾病新的治疗靶点的潜在应用价值，为深入了解BM-MSCs成骨谱系调控的分子机制提供了一个深刻的见解。