上半年，Molecular Cancer杂志在线刊登一篇苏州大学第一附属医院张立峰和陈彦两位老师共同通讯的文章CircWAC induces chemotherapeutic resistance in triple-negative breast cancer by targeting miR-142, upregulating WWP1 and activating the PI3K/AKT pathway。作者从circRNA对TNBC的化疗耐药性影响入手，发现circWAC通过miR-142/WWP1/PI3K/AKT信号机制促进TNBC的发生发展和PTX的化疗耐药性。
技术路线
circWAC在TNBC中异常表达
GEO数据库筛选出19个异常表达的circRNA分子，qRT-PCR验证发现其中有5个上调和5个下调，最终通过生存分析发现高表达circWAC的患者预后生存率较差。随后，作者对circWAC的环状结构进行验证。Sanger测序确定circWAC的环化位点，无法以gDNA为模板使用发散型的引物得到环化产物，circWAC相较于线性RNA更加耐受RNase R的消化，circWAC相比于母基因在放线菌素D中的半衰期更长均说明circWAC具有环化结构。通过核质分离和FISH荧光定位发现circWAC主要分布在细胞质。使用qRT-PCR验证发现circWAC在乳腺癌细胞中高表达，且在TNBC细胞中表达量最高。
Fig 1-2. circWAC的鉴定
CircWAC降低TNBC对PTX的化疗敏感性
作者分别过表达和沉默TNBC细胞中的circWAC，同时使用不同浓度的PTX作用TNBC细胞发现circWAC可以显著性促进TNBC细胞的增殖和成团，抑制细胞的凋亡。并且circWAC对于细胞活性的影响随PTX浓度增大而增强，降低了TNBC患者对PTX的化疗敏感性。
Fig 3. circWAC促进TNBC细胞增殖和成团，抑制细胞凋亡
CircWAC在TNBC中充当miR-142海绵
Circular RNA Interactome 和CircBANK数据库预测5个与circWAC具有潜在结合能力的miRNA。qRT-PCR检测过表达及敲低circWAC后TNBC细胞的miRNA表达情况，发现miR-142随circWAC的增多而降低，减少而增多。FISH荧光定位发现circWAC和miR-142主要分布于细胞质。随后作者使用RIP实验发现Ago2组的circWAC和miR-142表达高于IgG组，使用双荧光素酶实验进一步验证circWAC和miR-142的相互结合。相关性分析发现TNBC组织中circWAC和miR-142的表达呈负相关，qRT-PCR分析90对TNBC组织和癌旁组织发现癌组织中miR-142高表达。生存率分析发现高表达miR-142的患者预后存活率较差，通过METABRIC 和TCGA数据库的TNBC患者数据验证高表达miR-142的TNBC患者预后存活率较差。进一步通过细胞功能实验发现过表达circWAC可以逆转过表达miR-142对TNBC细胞增殖、成团和细胞凋亡的影响，因此circWAC可靶向miR-142调控化疗药物PTX的TNBC耐药性。
Fig 4-5. circWAC靶向miR-142调节PTX化疗耐药性
WWP1是miR-142直接下游靶基因
分别使用TargetScan、miRDB和miRNAMAP预测miR-142的下游靶基因，从150个预测基因中最终筛选出4个可能性最大的基因。RIP实验发现WWP1和miR-142存在相互结合，WB实验验证发现miR-142抑制WWP1的表达，双荧光素酶报告基因实验验证发现WWP1是miR-142的下游靶基因。免疫组化染色发现TNBC组织中WWP1高表达，WWP1发挥致癌基因作用，且生存率分析发现高表达WWP1的TNBC患者预后存活率较差。
Fig 6. WWP1是miR-142下游靶基因
体内外实验验证circWAC发挥生物学功能的信号机制
对TNBC细胞进行过表达miR-142和WWP1处理，WB分析细胞蛋白表达发现miR-142通过PI3K/AKT信号通路靶向WWP1发挥生物学功能。随后对TNBC细胞进行功能获得性实验分析发现过表达miR-142无法逆转WWP1对于TNBC细胞的功能促进作用，说明miR-142的抑癌作用具有WWP1依赖性，miR-142通过靶向WWP1激活PI3K/AKT信号通路增加PTX的药物敏感性。
作者将PTX作用转染sh-circWAC的TNBC稳转株细胞，处理后的细胞进行体内异位成瘤实验。通过肿瘤组织形态学分析和组织学实验以及WB实验进一步验证circWAC通过miR-142调控WWP1的表达和PI3K/AKT信号通路的激活，作为致癌基因发挥降低PTX药物敏感性的作用。
Fig 7-8. circWAC通过miR-142/WWP1/PI3K/AKT信号通路调控TNBC对PTX的化疗敏感性
TNBC化疗抗药性分子互作示意图
circWAC通过WAC基因的4-7外显子环化得到，circWAC竞争性与miR-142结合，减少miR-142和WWP1的3’UTR区域的结合进而抑制WWP1的分解。WWP1积累增多，通过PI3K/AKT信号通路增加TNBC患者PTX治疗时的化疗耐药性。
Fig 9. circWAC降低PTX化疗敏感性的信号机制
参考文献：
1. Lei Wang, Yehui Zhou, Liang Jiang, Linlin Lu, Tiantian Dai, Aoshuang Li, Yan Chen Lifeng Zhang. CircWAC induces chemotherapeutic resistance in triple-negative breast cancer by targeting miR-142, upregulating WWP1 and activating the PI3K/AKT pathway . Mol Cancer. (2021) 20:43 . https://doi.org/10.1186/s12943-021-01332-8.