C9ORF72基因的六核苷酸序列GGGGCC的重复序列是肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)最常见的遗传原因。该重复核苷酸序列通过核颗粒和重复序列相关的非AUG翻译产生的DPR蛋白介导毒性。然而，目前尚不清楚内含子重复序列如何输出到细胞质并被翻译。
约翰霍普金斯大学的Bin Wu和Shuying Sun老师于Nature Communications（IF 14.919)发表题为Nuclear export and translation of circular repeat-containing intronic RNA in C9ORF72-ALS/FTD的文章，使用纳米孔测序技术揭示了一种由重复扩增序列介导的非特异性致病RNA的结构特征，证明了RNA空间定位对理解疾病病因的重要性，并进一步证明剪接内含子可以作为RAN（核质穿梭蛋白）翻译的模板。此研究使用的单分子方法为区分环状RNA和原位线性RNA提供了一个重要的工具。
为了研究内含子背景下重复RNA的分子特征和空间动力学，作者设计了如图1所示的基因序列构建质粒，适用于不同RNA序列的直接可视化：同时含有24xMBS(MS2结合位点，洋红色)和24xPBS（PP7结合位点，青色）的未剪接的Pre-mRNA；只含有MBS的剪接内含子；以及只含有PBS的成熟mRNA。通过单分子荧光原位杂交(SmFISH：一种新的基因表达分析方法，能报告转录本丰度和空间定位)实验证实C9ORF72 GGGCCexp能够稳定剪接生成内含子并转运到细胞质，使其具有与成熟mRNAs相当的运动性。作者后续研究了其他扩展重复序列是否也能诱导剪接内含子的稳定和出核。通过与富含AT内含子序列与富含GC内含子序列进行比较，得出G-rich重复序列的二级结构对于稳定内含子剪接和介导内含子出核十分重要的结论。并发现NXF1-NXT1途径可以通过调节这类环状内含子RNA出核来调节患者细胞的内源性DPR水平。
图1 适用于不同RNA物种直接可视化的报告质粒
通过核酸外切酶RNase R只降解线性RNA，而不降解环状RNA的特性证实带有G-rich重复序列的剪接内含子由套索驱动环化形成环形结构。接下来，作者使用新生多肽的单分子成像(SINAPS)技术分析剪接的内含子是否在细胞质中发生RAN翻译，将24×Suntag荧光蛋白结合在(GGGGCC)70和MBS之间，当RNA被翻译时，新生蛋白立即被同一细胞中表达的荧光纳米体识别。实验结果显示，Suntag信号检测到翻译位点(TLS)与单内含子RNA分子定位在一起;smFISH和IF实验证实循环内含子才是RAN翻译的底物；体外转录的双顺反子报告实验证实GGGGCC重复序列的RAN翻译可以独立于5’帽端发生。值得一提的是，在亚砷酸钠诱导的氧化应激反应中翻译效率得到了提升。综上所述，实验数据支持环状剪接内含子可以作为RAN翻译模板，且RAN翻译受应力刺激上调。
图2 富含 G-rich重复序列剪接内含子的出核及翻译模型
目前，对于环状RNA出核转运机制仍知之甚少。最近的研究表明，TREX的成分DDX39B和DDX39A能够调节外显子CircRNA的出核，NXF1-NXT1系统能够调节细胞质circRNA的出核。对于含有重复序列的环状内含子，作者通过实验证明，在敲除NXF1-NXT1途径后，细胞质内含子数量和相应的RAN翻译产物减少得更多。
综上所述，敲低NXF1-NXT1途径后，细胞质内含子数目和相应的RAN翻译产物明显减少，这有助于改善重复RNA分子介导的神经系统致病性。本研究介绍了一种由重复序列诱发的非特异性致病RNA类型，这是少见的关于RNA分子空间定位与神经系统致病性之间关系的研究。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25082-9.pdf