自今年年初发表了两篇重量级 circRNA 研究文章之后，近日，又有一篇关于 Nanopore circRNA 研究的文章横空出世。由丹麦奥尔胡斯大学 Rahimi 等人的研究团队使用 Nanopore 对 circRNA 进行了大规模地解析，并发表在了 Nature Communications （IF 14.919)上。
文章概述
该文章主要讲述了 Nanopore 三代测序能够识别 circRNA 全长以及特异性可变剪切事件。并且作者还发现，与线性 RNA 相比，新外显子、内含子保留（intron retention）和微型外显子（microexon, 3~29nt）这三个事件均会优先在circRNA中发生。
作者开发了一套检测 circRNA 的流程——circNick-LRS (LRS, long-read sequencing)，分别在人类和小鼠大脑中鉴定了总共18266和39623个独特的circRNA。另外，作者还开发了一种检测 circRNA panel 的策略——circPanel-LRS，消除了此前circRNA富集的需要，并且还发现了每个靶向位点平均有>30个的 circRNA 亚型（详细流程如下图）。
图1. circRNA ONT测序流程
作者使用 circNick-LRS 检测到一些 circRNA 会保留内含子，例如 circREXO4 和 circCcar2（如下图 a/b），但仅在人类或小鼠中表达。而CircCAMSAP1 在人和小鼠中均有表达，但内含子保留事件仅发生在人脑中（如下图 c/d）。比较 circRNA 基因组区域中所有注释的内含子，作者发现短的内含子比长的内含子更有可能在 circRNA 中保留（如下图 e/f）。
图2. circRNA 中内含子保留事件的示例及其频率和长度分布
下图中展示了可变剪切 circRNA 外显子的例子，发现了两个全新的外显子——人类 circRBM23 和小鼠 circAtxn1都未被 RefSeq 注释。与相邻外显子相比，人类 circRBM23 中的新外显子表达程度较低，而小鼠 circAtxn1 中的新外显子是 circRNA 特异性的，并且在线性 mRNA 中不存在。有趣的是，作者发现较短的外显子更有可能在人和小鼠大脑中发生可变剪切。
图3. circRNA特异性可变剪接示例
作者注意到与神经发育障碍相关的几个微型外显子优先在 circRNA 中发现。尤其是 DTNA 和 Eif4g3 中的微型外显子主要以 circRNA 形式存在，与相邻外显子相比，其在circRNA中的内容物（inclusion）分别为 80% 和 32%，但在对应的线性RNA中则分别只有 3.5% 和 23%。通过 RT-PCR 和 Sanger 测序验证了人circDTNA、小鼠 circEif4g3 和小鼠 circDtna 中富含微型外显子。
图4. circRNA 中的微型外显子示例
结语
在这篇文章中，作者主要强调了以下几点内容：
• 再次申明了 long-read 测序方式不仅体现了检测除 BSJ 外的中间序列（internal composition），同时还能发现许多二代测序未发现的新 circRNA；
• 三代 circRNA 测序可以更方便研究 circRNA 的可变剪切事件，包括 intron retention 和新 circRNA 外显子的发现；
• 特别讨论了 circRNA 中新观察到许多微型外显子，目前研究表明这种外显子是转录组重要的调控子，特别是在神经系统中；当前已发现的微型外显子被证实与孤独症密切相关。因此，文章作者推测这些微型外显子可能作为转录调控子或 miRNA/RBP 的结合位点。
前有 isoCirc 和 CIRI-long 技术，现有 circNick-LRS，这三篇文章重点介绍了三代 circRNA 的测序及检测手段，让我们了解到三代 circRNA 测序能够填补二代测序难以企及的空白，相信不久就会涌现许多用三代测序技术来识别鉴定全新的时空特异性存在的circRNA 变体以及深入的功能与机制的研究。
参考文献
Rahimi K , Veno M T , Dupont D M , et al. Nanopore sequencing of brain-derived full-length circRNAs reveals circRNA-specific exon usage, intron retention and microexons[J]. Nature Communications, 2021.
