PTEN是人类癌症中最常见的突变抑癌基因，编码一个403氨基酸蛋白，具有磷酸酶依赖性和非磷酸酶依赖性功能，是人类癌症中最常见的突变抑癌基因之一[1]。虽然PTEN蛋白和PTEN亚型的作用已被广泛探讨，但目前对PTEN家族成员的了解还不能充分说明它们在生物过程和肿瘤发展中的多样性。值得注意的是，由PTEN产生的非编码RNAs的功能尚未被阐明。
环状RNAs是一类单链、共价闭合的RNA分子，属于非编码RNAs的一种。具有功能特征的环状RNAs通过多种机制在基因调控中发挥关键作用，包括海绵吸附miRNA和蛋白质，翻译功能性蛋白等。大量实验研究发现，环状RNAs通过参与调控肿瘤的侵袭和转移，广泛参与人类癌症的起始和进展，具有什么重要的功能。
上周，北京大学基础医学院尹玉新教授和梁会副研究员共同通讯在Molecular Cancer发表文章circPTEN1, a circular RNA generated from PTEN, suppresses cancer progression through inhibition of TGF-β/Smad signaling，本研究发现了一种由PTEN基因生成的具有肿瘤抑制功能的新型环状RNA，进一步揭示了circPTEN1在TGF-β介导的CRC转移中的作用机制。
首先作者通过circBase和 circInteractome两个数据库筛选出8个潜在的源自PTEN的环状RNAs。随后使用qPCR对8个潜在来源基因进行了验证，发现hsa_circ_0002232（circPTEN1）和hsa_circ_0019060（circPTEN2）两个基因在正常人结肠上皮细胞（NCM460）及相关结肠癌细胞（DLD1, LoVo and HCT116）中的表达量相对较高。进一步验证发现，circPTEN1在CRC组织中的表达明显低于相邻正常组织。circPTEN1表达较低的患者的总生存期明显短于circPTEN1表达较高的患者。结果显示circPTEN1可能是一种肿瘤抑制的非编码RNA, circPTEN1的异常调节可能有助于CRC的发生和进展。CircPTEN1由PTEN基因的1 – 5外显子环化生成，长度为508bp，主要在CRC细胞的细胞质中表达。
作者进行RNA pull-down实验，对拉下来的蛋白产物进行质谱检测，探究circPTEN1的RBP蛋白。质谱结果显示eIF4A3可以特异性的结合circPTEN1的上游侧翼序列，是一种调控外显子环化的蛋白质，也是一种潜在的circPTEN1调节器。CircInteractome预测发现，circPTEN1侧位相匹配的eIF4A3结合位点。如图1所示，RIP实验验证发现，eIF4A3可以通过相应RNA-蛋白复合物中的两个上游假定结合位点(f，g)与circPTEN1 mRNA结合。eIF4A3与circPTEN1的表达呈负相关，过表达eIF4A3可以逆转eIF4A3敲除产生的circPTEN1异常表达情况。结果显示，eIF4A3可能通过与侧翼序列结合来降低circPTEN1的表达。
图1.EIF4A3抑制circPTEN1的表达
作者通过pull-down实验，证明Smad4与circPTEN1之间存在相互结合。RIP检测发现circPTEN1与Smad4 MH2结构域相互结合。如图2所示，作者设计5个不同的circPTEN1缺失突变体进行pull-down实验，结果显示451 – 50nt长的区域覆盖了头尾背剪接结，使circPTEN1能够与Smad4结合。进一步功能实验证明，circPTEN1对TGF-β1介导的CRC迁移和侵袭活性的影响依赖于其与Smad4的相互作用。
图2.circPTEN1及缺失突变体模型
CircPTEN1与circPTEN1的MH2结构域相结合，而MH2结构域也是R-Smad/Smad4相互作用的结合位点[2]。在机制上，circPTEN1结合到Smad4的MH2结构域，破坏Smad4和Smad2/3之间的物理相互作用，导致Smad复杂核易位的抑制。CircPTEN1结合Smad4，可以抑制R-Smad/Smad4复合物的形成，从而抑制其易位，最终作为抑癌基因下调TGF-β1靶基因的表达。
CircPTEN1抑制R-Smad/Smad4复合物的形成和Smad2/3核转位，circPTEN1可能通过抑制TGF-β1/ smad介导的EMT来抑制CRC转移。如图3（A,B,C）所示，作者检测了circPTEN1对TGF-β1诱导的EMT（诱导上皮-间充质转化）相关基因表达的影响。与对照组相比，CircPTEN1敲除可增强TGF-β1/Smad信号转导靶向EMT基因的表达，而再次引入circPTEN1可减弱其表达。此外，下调circPTEN1显著增强了TGF-β1诱导的Snail、Slug或ZEB1基因表达，而这些升高的转录激活可以通过再次引入circPTEN1而被抑制。蛋白水平验证发现，在TGF-β1处理下，circPTEN1敲低可增强上皮标记物的丢失和间充质标记物的获得，而circPTEN1过表达则检测到相反的反应。结果表明circPTEN1对TGF-β1诱导的EMT有抑制作用。
Ski是一种著名的TGF-β信号抑制因子，它可以干扰Smad复合体的形成，以响应TGF-β在smad4/R-smad结合之间的作用。如图3（D,E,F）所示，Ski过表达可显著抑制因circPTEN1敲低而导致的Snail、Slug或ZEB1表达升高和CRC细胞运动能力增强(图6D、E、F)，进一步证实了circPTEN1通过抑制TGF-β1/ smad介导的EMT来抑制CRC转移。
图3.circPTEN1通过抑制TGF-β/ smad介导的EMT抑制CRC转移
本研究发现了一种由PTEN基因生成的具有肿瘤抑制功能的新型环状RNA，进一步揭示了circPTEN1在TGF-β介导的CRC转移中的作用机制。这增加了PTEN基因可能产生更多尚未确认的环状RNA的可能性。通过对PTEN基因环状RNA的鉴定，进一步阐释了PTEN在生理和病理过程中功能的多样性和复杂性。
circPTEN1介导TGF-β/smad信号参与CRC的机制
原文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s12943-022-01495-y.pdf
参考文献：
[1].Hopkins BD, Hodakoski C, Barrows D, Mense SM, Parsons RE. PTEN function: the long and the short of it. Trends Biochem Sci. 2014;39:183–90.
[2]. McCarthy AJ, Chetty R. Smad4/DPC4. J Clin Pathol. 2018;71:661–4.