食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在癌症相关死亡中排名第六[1]。食管癌主要包括两种病理类型：食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。全世界近90%的ESCC患者在中国。由于缺乏有效的靶向治疗药物，患者的五年生存率仍然只有15-25%。
研究表明，肿瘤细胞的能量代谢与正常细胞不同。沃伯格效应（Warburg effect）指在氧气充足的情况下，肿瘤细胞优先通过糖酵解提供能量。已有研究表明在某些类型的肿瘤细胞中的氧化磷酸化没有受损，甚至出现增强[2]。但是，关于环状RNAs是否参与氧化磷酸化过程的报道较少。
上周，北京大学詹启敏院士团队在Signal Transduct Target Ther杂志上在线发表了题为Nuclear genome-derived circular RNA circPUM1 localizes in mitochondria and regulates oxidative phosphorylation in esophageal squamous cell carcinoma的文章，揭示了circPUM1参与ESCC的作用机制。研究发现，circPUM1通过维持线粒体复合物III的稳定性，在增强ESCC细胞ATP生成的氧化磷酸化方面起着关键作用，并且提出ESCC细胞在细胞适应过程中利用circPUM1。
首先，作者在食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系KYSE30中构建了CoCl2诱导的细胞内缺氧样微环境模型。处理完成后，进行全转录组测序筛选目标环状RNAs分子，其中106个上调，73个下调。尽管circPUM1、circSLC8A1和circZNF292在细胞内缺氧模型中显著上调，只有circPUM1的母基因PUM1 mRNA的表达未发生明显的变化，作者选取circPUM1进行后续的研究。
ESCC细胞内缺氧样微环境建立
随后，体内外实验分别验证了circPUM1的致瘤功能。作者发现，过表达circPUM1促进ESCC细胞增殖和集落形成，circPUM1基因敲除可以显著抑制裸鼠体内成瘤的大小和质量。生存率分析发现，circPUM1的表达升高与ESCC患者的总体生存率降低相关。
作者使用CircPUM1的3’端生物素标记的反义和正义探针进行RNA下拉分析。通过银染色带回收获得circPUM1反义探针选择性沉淀的蛋白质，并进行质谱分析。对质谱的候选蛋白进行验证，通过 RNA pulldown-wb和RIP-qPCR实验证明UQCRC2可以与circPUM1相互作用，并通过FISH-IF证明二者共定位与线粒体。进一步机制研究发现，circPUM1通过与ESCC细胞中的UQCRC2相互作用来调节线粒体能量代谢。
CircRNA作为蛋白质复合物组装的支架，属于环状RNA与蛋白相互作用的一种重要的方式[3]。已有研究发现，UQCRC2与UQCRC1相互作用，在线粒体复合物III中形成核心二聚体，将氢离子从线粒体基质泵送到线粒体膜间空间[4]。作者通过co-IP实验，发现circPUM1基因敲除导致UQCRC2和UQCRC1之间的强烈相互作用。相比之下，circPUM1的过表达破坏了这两种蛋白质之间的相互作用。
探针设计及下拉蛋白银染
作者发现，circPUM1和UQCRC2缺失引起KYSE30细胞中的线粒体膜电位（MMP）降低。MMP的降低可以显著性改善ESCC细胞的氧化应激反应。由于线粒体功能障碍通常伴随着异常的线粒体形态，作者使用超分辨率显微镜在亚细胞器水平上分析了circPUM1干扰的ESCC细胞中线粒体的状态。如图1所示，随着circPUM1的干扰，线粒体的形态从丝状变为碎片，进一步说明了circPUM1在维持线粒体功能中的重要性。总之，circPUM1通过为可调节的线粒体复合物III组装提供支架来维持线粒体内稳态。
图1. 超分辨显微镜观察结果
细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡，与炎症和肿瘤发生密切相关[5]。线粒体膜电位的降低可能导致线粒体活性氧的增加，细胞内活性氧的增加和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3蛋白的断裂可通过激活GSDME促进肿瘤细胞焦亡。作者验证发现，ESCC细胞中的circPUM1周围的线粒体能够通过调节细胞内ATP水平来抑制细胞焦亡。
相衬显微镜观察细胞凋亡结果
综上所述，本研究进一步证实了线粒体在细胞焦亡中的重要作用。在CoCl2诱导的ESCC细胞内缺氧样条件下，circPUM1的表达水平与HIF1α的积累呈正相关。CircPUM1在ESCC细胞系中充当UQCRC1和UQCRC2之间相互作用的支架。干扰circPUM1可导致细胞内氧浓度降低、氧化磷酸化下调、线粒体膜电位降低、活性氧生成增加和线粒体收缩。CircPUM1缺失导致线粒体复合物III的功能障碍和caspase3的自发切割。CircPUM1的干扰导致焦亡，引发ESCC细胞系的细胞死亡。此外，本研究表明circPUM1为ESCC肿瘤治疗提供新的靶点。
circPUM1调节ESCC细胞氧化磷酸化机制
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-021-00865-0.pdf
参考文献：
[1]. Alsop, B. R. & Sharma, P. Esophageal cancer. Gastroenterol. Clin. North Am. 45, 399–412 (2016).
[2]. Ashton, T. M., McKenna, W. G., Kunz-Schughart, L. A. & Higgins, G. S. Oxidative phosphorylation as an emerging target in cancer therapy. Clin. Cancer Res. 24, 2482–2490 (2018).
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[5]. Bergsbaken, T., Fink, S. L. & Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat. Rev. Microbiol. 7, 99–109 (2009).