结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率近年来一直居高不下[1]。尽管一些方法已经应用于临床，包括结肠镜检查、乙状结肠镜检查和粪便检测，但结直肠癌的早期检测和诊断仍然具有挑战性。迫切需要寻找新的结直肠癌生物标志物。
外泌体具有脂质双层膜结构，粒径在40-120nm之间。已有研究发现，外泌体被认为是体内生物标志物的重要来源，外泌体在细胞间信号传导中起着信使的作用，它将来自母细胞的特定物质传递给参与疾病发展和进展的受体细胞[2]。环状RNAs具有共价闭合的环状结构，与亲代线性RNA相比，具有高度稳定性。外泌体作为结直肠癌新的生物标志物的的作用尚未得到系统研究。
近日，南京医科大学王美林教授，杜牧龙副教授和刘凌翔主任医师共同通讯在Molecular Cancer杂志在线发表文章Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3–eIF3h interaction，本研究强调了血浆外泌体中的circLPAR1在结直肠癌诊断中是一个有前途的预测因子，并描述了其对结直肠癌发生的生物学调节。为临床早期诊断和疾病发展的发病机制研究提供了新的视角。
作者通过RNA-seq分析52对结直肠癌组织和癌旁组织，表征结直肠癌中失调的环状RNAs。经过过滤筛选，相对于正常癌旁组织，作者发现五个在结直肠癌组织中显著性低表达的环状RNAs。使用exoRBase数据库注释外泌体中高丰度的环状RNAs，最终验证发现hsa_circ_0087960（circLPAR1）是唯一在结直肠癌细胞中表达显著下调的环状RNA。
exoRBase数据库注释外泌体高丰度环状RNAs
CircLPAR1由位于chr9（113734352-113735838）上的LPAR1基因的第3外显子和第4外显子反向剪切形成环状RNA分子，长度226bp。如图1所示，作者对79位受试者进行临床分析，circLPAR1在结直肠肿瘤中的表达水平显著低于癌旁组织，且circLPAR1主要在细胞质中表达和定位。高circLPAR1水平的结直肠癌患者的总体生存率明显高于低circLPAR1水平的结直肠癌患者。
图1. circLPAR1在CRC细胞(放线菌素D处理)及肿瘤组织（FISH）中表达情况
外泌体作为潜在生物标志物，在细胞和组织间发挥信使功能。环状RNAs在各种病理条件下的组织和体液中存在差异表达，是生物标志物的宝贵来源。与对照组相比较，结直肠癌患者的外泌体circLPAR1显著降低，这表明在从癌前病变发展为癌症的过程中，外泌体circLPAR1可能降低。如图2所示，作者在不同的肿瘤中观察到相同的表达模式。该表达模式证明，血浆外泌体circLPAR1是结直肠癌诊断的特异性生物标志物。进一步细胞功能实验发现，circLPAR1通过外泌体在细胞间传播并抑制细胞表型。
circLPAR1在不同肿瘤组织中的表达情况
作者使用circRNA pull-down技术进行circRNA下拉试验，进而对下拉蛋白产物进行质谱分析。CircRNA pull-down技术是使用带有MS2捕获蛋白（MS2-CP）的circRNA下拉分析来确定与circLPAR1相关的RNA结合蛋白（RBPs）[3,4]。如图2所示，该技术是在吉赛生物专利技术circRNA过表达载体基础上，将RNA标签体系引入circRNA中，通过RNA标签和捕获蛋白的高度特异且稳定相互作用，进行靶分子捕获和相互作用分子的捕获。相对于探针分子的捕获，该技术具有得天独厚的优势：
1. 实验体系捕获的是环形的circRNA分子，更能模拟circRNA的天然形态，相对“线性RNA替代法”可信度更高；
2. 通过circRNA过表达载体引入外源标签，可降低来源基因的背景干扰；
3. RNA标签与捕获蛋白间的相互作用远远强于探针分子的捕获作用，特异性也更高，能够更高效的捕获靶分子；
4. RNA标签插入的位置可根据实际情况灵活设计，能有效避免竞争性探针导致的junction位置相互作用分子信息的丢失问题；
5.不依赖于细胞内本底表达的circRNA量，对细胞内表达丰度低的circRNA同样适用。
图2. 外泌体circLPAR1可以结合eIF3h
eIF3h和甲基转移酶样3（METTL3）之间存在直接的物理和功能相互作用，后者可以调节含溴代烷蛋白质4（BRD4）的翻译并影响肿瘤发生[5]。
作者将转染circLPAR1/NC慢病毒载体的DLD1细胞系注入人源化NCG小鼠进行体外成瘤实验，成瘤15天后，在NC组小鼠皮下隔天分三次注射DiR标记的circLPAR1/NC Exos。组织形态学分析发现，与体外实验结果一致，外泌体circLPAR1在体内抑制结直肠癌生长 。且circLPAR1在体内外均能抑制BRD4表达。
动物实验造模
综上所述，本研究发现了一种新的结直肠癌相关circRNA，称为外泌体circLPAR1。外泌体circLPAR1易被在血浆外泌体中检测到，可能作为人群筛查和结直肠癌早期检测的一种生物标记物。外泌体circLPAR1被CRC细胞内化，并抑制肿瘤生长，可能是因为与eIF3h直接结合的外泌体circLPAR1特异性地抑制METTL3-eIF3h相互作用，减少癌基因BRD4的翻译。
图文摘要示意图
原文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s12943-021-01471-y.pdf
参考文献：
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