膀胱癌(BCa)是导致泌尿生殖系统癌症相关死亡的最常见的肿瘤疾病，每年约有524,000个新病例和229,000人死亡[1]。在多种致死因素中，淋巴结(LN)转移被认为是BCa预后不良的主要原因，患者的5年生存率不到20%。而淋巴管生成是BCa淋巴结转移的必要和限制性过程。
环状RNAs (circRNAs)是共价封闭的RNA分子，通过诱导肿瘤细胞上皮-间充质转化(EMT)、干细胞和免疫逃逸，参与调控肿瘤转移。在反向剪接环状RNAs分子中，大多数主要位于细胞质中，而含有保留内含子的环状RNAs被隔离在细胞核中。研究表明，肿瘤的恶性转化常常伴随着环状RNAs亚细胞定位的平衡减弱。异常的环状RNAs核输出导致细胞内信号转导的失调，使肿瘤细胞获得侵袭性表型，并激活肿瘤转移级联。然而，circRNAs在BCa淋巴结转移中的核输出机制仍不清楚。
上周，中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科林天歆主任医师团队在Cancer Research杂志上发表了一篇题为 Aberrant Nuclear Export of circNCOR1 Underlies SMAD7-Mediated Lymph Node Metastasis of Bladder Cancer的文章，本研究鉴定了新的内含子保留的circNCOR1，并阐明了一种类泛素化修饰介导的DDX39B-circNCOR1-SMAD7信号调控膀胱癌淋巴结转移。
作者首先对4对BCa组织和NAT进行测序（GSE191036），通过构建共培养体系筛选出两个强侵袭性的细胞（UM-UC-3，T24），与现有数据库信息（GSE77661）比对筛选出七个环状RNAs在高侵袭性BCa细胞和BCa组织中一致下调。随后作者在228对临床样本中，证实circNCOR1 (hsa_circ_0042174)是BCa组织中与NAT相比下调最显著的环状RNAs，在LN 转移的BCa组织与未发生LN转移的BCa组织相比较中下调最显著的环状RNA。
CircRNA的特定外显子和内含子的反向剪接决定了它们的亚细胞定位和生物学功能，研究发现circNCOR1的成熟序列包含一个内含子18的残留片段和来自NCOR1基因的整个19外显子序列。研究团结队使用RNase R(核糖核酸外切酶R，广州吉赛生物)处理显著降低线性NCOR1 mRNA水平，而circNCOR1的量未观察到明显的改变，证明circNCOR1是一个高度稳定且内含子保留的环状RNA。
circNCOR1的反向剪切
DDX39家族，包括DDX39A和DDX39B，是负责circRNA核-细胞质转运的重要调控因子[2]。作者通过FISH定位发现，circNCOR1主要在低侵袭性的细胞UM-UC-1的细胞核中（图1F），而主要存在于高侵袭性的细胞UM-UC-3的细胞质中（图1E）。
Western blotting结果显示，DDX39B在UM-UC-3和T24细胞中有一个额外的高分子量条带明显过表达，表明在高侵袭性BCa细胞中PTM（蛋白翻译后修饰）水平较高。使用不同的PTM抑制剂处理细胞发现，类泛素化修饰（SUMOylation）抑制剂2-D08处理后，DDX39B的PTM水平显著降低，表明DDX39B在BCa中被SUMOylated（图1G，H）。赖氨酸53 (K53)是SUMOylation修饰的潜在结合位点，DX39B在K53位点被SUMO2修饰，SUMO2修饰促进DDX39B介导的circNCOR1核输出。
图1. SUMOylated DDX39B促进circNCOR1的核输出
使用UM-UC-3和T24细胞与HLECs的共培养体系，进行成管实验发现干扰UM-UC-3和T24细胞显著提升HLECs管形成，并提升了HLECs的迁移能力。体内实验进一步验证了这一结果，circNCOR1在体内抑制BCa的淋巴管生成和淋巴结转移。突变SUMO2修饰区域K53可以显著性的逆转circNCOR1对BCa的淋巴管生成和淋巴结转移的抑制作用。
为探究circNCOR1发挥功能的作用机制，作者使用pull-down实验对circNCOR1的下拉产物进行分析，发现hnRNPL被circNCOR1显著性富集，且主要通过hnRNPL的80 – 130nt基序产生富集。过表达circNCOR1进行转录组分析，下游基因的信号通路富集主要发生在TGFβ信号通路。SMAD7 在过表达circNCOR1的BCa细胞中显著上调，在敲除circNCOR1后下调。SMAD7是TGFβ-smad信号通路的内源性负调控因子，抑制TGFβ受体介导的smad磷酸化[3]。circNCOR1直接与SMAD7启动子的P3区结合，形成DNA-RNA三重链并激活SMAD7转录。已有报道发现，hnrnpl诱导的组蛋白修饰有助于靶基因的转录激活[4]。CircNCOR1通过招募hnRNPL增加SMAD7启动子上组蛋白乙酰转移酶p300依赖的H3赖氨酸9乙酰化(H3K9ac)来激活SMAD7的转录。
如图2所示，作者建立异种移植(PDXs)模型，在PDX模型中过表达circNCOR1和抑制TGFβ/SMAD信号通路可显著抑制肿瘤体积的增长，而siSMAD7则表现出相反的作用。CircNCOR1在BCa淋巴结转移中起抑制作用。结合228例BCa患者分析，circNCOR1通过上调SMAD7，以SUMOylated DDX39B依赖的方式，抑制BCa淋巴结转移。
图2. PDXs模型的建立
总之，本研究强调了sumoylation诱导的circNCOR1的核输出，通过DDX39B-circNCOR1-SMAD7轴调控BCa的淋巴管生成的一种新机制。在机制上，核circNCOR1 21通过增加SMAD7启动子上的H3K9乙酰化，将hnRNPL募集到SMAD7启动子上，并激活SMAD7的转录，从而抑制TGFβ-SMAD信号转导。而SUMOylated DDX39B诱导circNCOR1核输出，削弱其在BCa LN转移中的抑制作用。此外，作者证明阻断DDX39B SUMOylation恢复了circNCOR1在体内对BCa LN转移的抑制作用，为sumoylation驱动的环状RNA核输出触发BCa淋巴管生成的调控机制提供了新的认识，表明circNCOR1是一种有效的LN 转移性BCa的治疗抑制剂。
circNCOR1核输出参与膀胱癌淋巴管转移的机制
原文链接：https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-21-4349
参考文献：
[1]. Teoh JY, Huang J, Ko WY, Lok V, Choi P, Ng CF, et al. Global Trends of Bladder Cancer Incidence and Mortality, and Their Associations with Tobacco Use and Gross Domestic Product Per Capita. Eur Urol 2020;78:893-906
[2]. Huang C, Liang D, Tatomer DC, Wilusz JE. A length-dependent evolutionarily 2 conserved pathway controls nuclear export of circular RNAs. Genes Dev 3 2018;32:639-44
[3]. Ikushima H, Miyazono K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer 2010;10:415-24
[4]. Zhao Z, Shilatifard A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biol 2019;20:245