生物材料具有独特的性能和不可替代的应用。纤维蛋白，如各种毛虫蛋白和蛛丝蛋白，作为一种独特的生物材料，具有人造材料所没有的强度和韧性。蜘蛛丝是自然界中最强的纤维之一，是一种具有广泛应用潜力的生物材料。蜘蛛丝中强度最好的牵引丝由主壶腹腺蛛丝蛋白（MaSp）组成，拖丝MaSp包括MaSp1和MaSp2两个组成部分。与拖丝相比，鞭毛状丝(FLAG)的抗拉强度不高，但它具有优良的延展性，使其能够形成球形网的捕获螺旋。蜘蛛丝研究的一个主要目标是发展可能的大规模生产技术。然而，由于蜘蛛通常具有攻击性、领地性，甚至是同类相食的，因此实际上不可能培养野生蜘蛛来生产类似蚕丝的蛛丝。
MaSp1的核心表达模板是一个长且高度重复的DNA序列。DNA模板中重复序列过多，导致DNA重组，基因片段丢失，蛋白质翻译提前终止。质粒上的重复基因在细菌宿主中是不稳定的，MaSp1类基因在工程菌宿主中的终止错误率较高，极大地限制了蛛丝蛋白生产技术的发展。
环状RNA具有稳定的闭合环状结构。利用环状RNA可翻译的机制，使用mRNA环化技术设计携带一个蛛丝蛋白开放阅读框(ORF)的cmRNA。由于cmRNA的环状结构，理论上cmRNA为核糖体提供了一个无限的翻译模板，在核糖体脱离环状mRNA模板之前会产生长重复肽。
2022年4月6号，天津市工业生物技术研究所的张学礼研究员和毕昌昊研究员在Appl Environ Microbiol联合发表文章Engineering Circularized mRNAs for the Production of Spider Silk Proteins，在该研究中，作者报道了高达~110 kDa的重组MaSp1蛋白和高达~88.2 kDa的重组FSLP(鞭毛状丝样蛋白)的生产。
如图1所示，为了确保核糖体不翻译未经加工的线性mRNA的蛛丝蛋白的ORF，核糖体结合序列(RBS)和翻译起始密码子ATG位于MaSp1或FSLP编码序列的下游(图1A)。因此，调控序列在mRNA环状化后才位于编码序列的上游。为了纯化得到的MaSp1或FSLP多肽，将His标记加入到ORF中(图1A)。如果mRNA是环状的，核糖体可以环绕cmRNA，产生一个长重复多肽(图1B)。
图1.基于td侧翼内含子环状蛛丝mRNA的设计
作者对逆转录cDNA产物进行针对BSJ位点的qPCR检测，发现了超过一个循环的DNA 模板。因此，常规的量化方法无法准确对环化产物定量。
作者使用SplintQuant，在此方法中，使用经过修饰的PBCV-1 DNA连接酶，将DNA寡核苷酸靶向直接位于circRNA背离接头侧翼，可以检测特异性circRNA，其不受同源线性 RNA、含内含子序列的circRNA及目标circRNA的片段大小影响。将M13通用引物序列整合到circRNA特异性寡核苷酸的侧翼上，就能在没有逆转录（qPCR）的情况下对连接的DNA探针进行定量PCR[1]。对线性转录本的环化效率统计发现，MaSp1和FSLP转录本环状化的比例分别为8.5%和36.7%。td外显子在5’和3’内含子剪接位点之间的最佳长度为300到500个核苷酸，而MaSp1 cmRNA的一个单位只有156个核苷酸，MaSp1 mRNA的大小可能是导致其环化效率较低的主要因素。
SplintQuant对cmRNA相对定量
作者使用BL21感受态细胞转化pcirMaSp1和pcirFSLP质粒，分别培养表达MaSp1和FSLP蛋白。对蛋白产物进行凝胶电泳发现，cmRNA可以为核糖体提供一个环形的翻译模板，使核糖体能够持续对模板序列进行翻译。对蛋白样本进行WB检测，MaSp1多肽由大小为5.1 kDa的重复单元组成。MaSp1重复多肽混合物中，最小的条带约为10 kDa，极有可能是一个二聚体MaSp1肽，而凝胶上最大的可分化条带约为110 kDa，表明核糖体可以沿着MaSp1 cmRNA移动至少22圈（图2-Light）。MaSp1多肽FSLP由大小为9.8 kDa的重复单元组成。与MaSp1相似，纯化后的FSLP是具有不同重复单元数的FSLP的混合物（图2-Right）。
图2.纯化蜘蛛丝蛋白的WB检测
测定蛋白产物浓度，并对产品效价进行评估，MaSp1和FSLP两种蛋白的产品滴度分别为22.1 mg/L和81.5 mg/L，细胞干重产率分别为4.4 g/kg和16.5 g/kg。滴度结果4倍的差距，与MaSp1和FSLP的mRNA环化效率8.5%和36.7%一致。作者推测环化效率是影响产品效价的重要因素，mRNA的大小可能导致其循环效率低，导致cmRNA的工作浓度低，产物滴度降低，因此重复单元的长度可能是决定cmRNA是否为表达纤维蛋白的最佳策略的关键因素。
与之前的研究(表1)相比，本研究提供了一种简单的表达重组蜘蛛丝的策略。对于深入研究的MaSp1，与基于长重复DNA模板的生产相比，本研究的生产效价相对较低。然而，对于更大的和新的FSLP的生产，cmRNA表达策略提供了比传统方法更高的产量。
蚕丝冻干样本
表1.不同的宿主系统在重组蛛丝蛋白生产中的性能
本研究设计并建立了便于外源表达MaSp1、FSLP等具有串联重复序列的大蛋白的cmRNA技术，这些蛋白属于一类性能优越的重要生物材料。cmRNA为核糖体提供了无限的翻译模板，并产生了长重复肽。利用该技术，分别获得了大于110 kDa和90 kDa的重组MaSp1和FSLP，二者均包含数十个重复单元。该技术使得人工构建各种蚕丝蛋白和类似结构的蛋白非常方便，且成本和劳动强度最小。这种革命性的技术将使研究人员能够轻松地构建、研究和实验大量的丝状蛋白质，这些蛋白质的序列来自自然基因或人工设计。cmRNA技术将显著加速纤维蛋白为基础的生物材料发展。
原文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/aem.00028-22
参考文献：
[1].Conn V, Conn SJ. 2019. SplintQuant: a method for accurately quantifying circular RNA transcript abundance without reverse transcription bias. RNA 25:1202–1210. https://doi.org/10.1261/rna.070953.119.