肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因[1]。肝癌发生、转移和耐药的潜在分子机制仍不清楚，识别预后生物标志物，探索肝癌发生和发展的潜在机制，开发靶向治疗是非常必要的。
研究表明，circRNA可以作为miRNA的海绵或与蛋白质结合，改变circRNA水平可以导致基因产物的异常表达。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是一个新兴的表观遗传学调控方式，具有多种功能，包括剪接、输出、蛋白质翻译、稳定性和肿瘤发生。m6A介导的circRNA的功能调控有待进一步的探究。
siRNA是短的双链RNA，能够使互补信使RNA（mRNAs）的序列特异性基因沉默，诱导mRNA降解并抑制靶蛋白的产生。基于siRNA的疗法已成为针对多种疾病的一种有前途的策略。裸siRNA分子在血液中被核酸酶迅速降解，并在体内经历快速肾清除，siRNA的大尺寸和负电荷阻碍了其穿透细胞膜和细胞内积聚。有效递送是将siRNA带到靶细胞和组织中的关键问题。聚β-氨基酯（PAEs）是一类重要的生物可降解合成聚合物，可被细胞内酯酶降解，从而显著改善生物相容性，现已被作为基因和药物递送载体以及组织工程支架[2]。
2022年5月6日，中南大学生命科学学院夏赞贤教授在Molecular Cancer上发表文章M6A-mediated upregulation of circMDK promotes tumorigenesis and acts as a nanotherapeutic target in hepatocellular carcinoma，研究揭示了circMDK可能作为肝癌的潜在生物标志物，并为肝癌的治疗提供了一种有前途的纳米治疗策略。
作者对10对HCC和邻近非癌肝(ANL)组织进行总RNA测序，发现hsa_circ_0095868（circMDK）显著上调，高表达circMDK的患者预后较差。在35对肝癌组织中进行验证了circMDK的显著性高表达（74.3%，35例中的26例）；且相对于正常肝细胞系（LO2），circMDK在Hep3B和Huh7细胞显著性高表达。
功能实验发现，在体外沉默circMDK可减少增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。
作者使用在线工具m6A Avar（http://m6avar.renlab.org/）分析预测circMDK的5号外显子上存在RRACU的m6A修饰基序（图1A）。MazF毒素（ACA序列特异性内核糖核酸酶）对m6A位点敏感，是第一种对m6A敏感的RNA切割酶（图1B）。通过对细胞中的MazF表达进行qPCR检测，在Hep3B和Huh7细胞中检测到了更高的m6A水平（图1C）。并检测到了IGF2BP1蛋白（m6A reader）的高表达，证明IGF2BP1蛋白是circMDK的m6A结合蛋白，进一步在肝癌组织中检测到IGF2BP1的高表达（图1D,E,F）。Pull-down实验银染结果显示，circMDK探针组中circMDK和IGF2BP1显著富集（图1H）。此外，RIP实验发现，与IgG颗粒相比，使用抗IGF2BP1抗体在IGF2BP1免疫沉淀剂中观察到circMDK显著富集（图1I）。用放线菌素D阻断新合成的circMDK RNA后，沉默IGF2BP1降低了circMDK的RNA稳定性（图1J,K）。相关分析还表明，circMDK的表达与IGF2BP1呈正相关（图1L）。表明IGF2BP1在体外可以与circMDK结合，m6A修饰增强了circMDK的转录组稳定性，这可能部分解释了HCC中circMDK的显著上调。
图1.IGF2BP1识别m6A修饰的circMDK并提高circMDK的转录稳定性
为探索circMDK的海绵机制，作者对circMDK的潜在靶点进行了预测，并选取7个进行后续的验证。作者使用pull-down实验和RIP实验证明，circMDK直接吸附miR-346和miR-874-3p发挥作用。并使用荧光素酶报告基因实验，验证了circMDK上的miRNA结合位点。同时，对miR-346和miR-874-3p的共同靶基因进行预测，发现CircMDK可作为miR-346和miR-874-3p的海绵来增加ATG16L1的表达，并通过功能挽救实验证明ATG16L1负责circMDK介导的细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。
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荧光素酶检测结果
Lipo3000递送siRNA可以有效地抑制circMDK的表达，并在体外抑制其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。针对circMDK上调在肝癌中的关键作用，作者开发了一种靶向circMDK的siRNA有效载体（PAEs），将circMDK siRNA顺利包裹，且可以耐受FBS环境的降解。作者进一步构建PDX肿瘤模型，检测PAEs材料的体内递送效果。处理期间，小鼠体重没有显著变化，治疗组没有明显的全身毒性。使用P3及后续代数的PDX小鼠开展实验，荧光成像显示PAE-Cy5-siRNA对肿瘤部位的靶向效果优于游离Cy5-siRNA，与体外实验对肝癌细胞的靶向效果一致。进一步将HepG2细胞注射到Balb/c裸鼠的肝下叶形成原位肿瘤，在原位肿瘤模型中验证了PAEs对circMDK siRNA的递送和功能验证。
体内定位结果（PDX模型，原位肿瘤模型）
总的来说，circMDK通过circMDK-miR-346/miR-874-3p-ATG16L1信号通路发挥致癌功能，在肝癌的发生和发展中发挥重要作用。本研究首次证明通过靶向circRNA的PAE-siRNA复合物直接有效地抑制HCC，为HCC提供了一种有前途的纳米治疗选择。