环状RNAs是一种共价闭合的单链RNA(ssRNAs)，广泛存在于动植物体内。ssRNA的环状形式最初在植物病毒中被发现，2013年以来，RNA测序（RNA seq）技术的出现，以及生物学技术研究的不断深入，已发现环状RNAs在多种动植物细胞和组织中广泛表达，环状RNAs在生物调节过程中的重要作用不断被发掘。过去10年中，环状RNAs研究出现了机遇和挑战。它们的环状构象和序列与线性同源mRNAs重叠，使得检测和量化方法具有挑战性，并赋予了这些环状转录本在生物学研究中巨大的潜力。
2022年5月17号，中科院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲教授在Cell上发表了一篇题为Circular RNAs: Characterization, cellular roles, and applications的综述，在这篇综述中，作者讨论了解决环状RNAs研究的方法、其细胞作用的进展以及在生物医学研究和治疗中的应用。
作者从环状RNA研究的方法、细胞生物学功能机制、生物学应用三个方面，汇总了环状RNAs研究的相关内容，分析了环状RNAs的研究现状。
一．环状RNAs研究方法
除了剪切位点以外，环状RNAs拥有与其同源线性RNA相同的序列（图1A），与线性异构体的区分是功能机制研究的关键和挑战。作者从现有的新研究方法入手，概述了环状RNAs研究的关键步骤和策略。
1. 环状RNAs的富集（图1B）
在测序前，需要对环状RNAs进行富集分析，RNase R可以特异性的清除线性转录物而对环状RNAs影响较小，RNase R处理样品可以显著地富集环状RNA。基础研究过程中，使用RNase R处理样本，对样品进行电泳分析也是识别环状RNAs的重要方法。
2. 环状RNAs的测序（图1C）
预处理测序样本后，针对反向剪切位点（BSJ）进行识别是环状RNAs鉴定的关键。利用二代测序的短读方法可以特异性的识别BSJ，但是该方法存在固有的缺点。三代纳米孔长读测序可以实现实现长达1000 nt的序列读取，对长度约为150 nt的外显子可以准确识别。
3. 环状RNAs的验证（图1D）
除了以上提到的RNase R的处理方法，对PCR产物的Sanger测序推测BSJ位点也是识别环状RNAs的一种方式。另外，针对长度超过50 nt的RNA，在PAGE胶中，具有相同序列的环状RNAs迁移速度比线性RNA慢，也可用于验证环状RNAs。
4. 环状RNAs的定位（图1E）
环状RNAs在细胞中不是均匀分布，具有独特的亚细胞功能定位。类比mRNA，核质分离后进行qPCR检测环状RNAs的表达情况可以为环状RNAs的定位提供线索。由于细胞器的RNA污染，核质分离检测环状RNAs存在天然的缺陷。使用RNA荧光原位杂交（FISH），设计反义探针靶向BSJ位点序列，检测单个细胞中的环状RNA的定位情况。但是探针的敏感性和BSJ序列位置结合的其它RNA或蛋白质可能会影响定位的准确性。
5. 环状RNAs的功能机制（图1F，H）
核定位的环状RNAs不会被翻译，胞质定位的环状RNAs的核糖体结合位点的分析，以及m6A位点的修饰是决定其翻译的关键。同时，跨越BSJ位点的ORF是环状RNAs发挥特异性功能的基础。
RNA的免疫沉淀可用于环状RNAs-RBPs的研究，此外，环状RNA-miRNA信号轴的转导也需要在不同的细胞背景下进行研究。
6. 环状RNAs的干扰和过表达（图1I，J，k）
目前，环状RNAs的干扰主要使用RNAi和CRISPR的方法。以BSJ位点为靶点设计短发夹状RNA（shRNA）和小干扰RNA（siRNA），已被用于敲除环状RNAs和大规模文库的筛查；CRISPR-Cas9可被用于移除整个后剪切外显子，在不影响母基因mRNA表达的前提下；以产生环状RNAs敲除（KO）小鼠转基因模型；基于RNA靶向VI型CRISPR-Cas13的策略可以有效区分环状RNAs和同源线性mRNAs，降低脱靶效应。
在成环元件作用下的外显子序列的过表达载体，是环状RNAs的常用的过表达系统。成环效率低，以及线性转录的存在需要线性RNA的背景对照进行完善；通过体外转录线性RNA的T4 RNA连接酶连接和I型内含子剪切的环化方式可以实现环状RNAs的体外人工制备，内含子剪切会引入大量的非目的序列，后续体外和体内实验过程中，使用高纯度和低免疫原性的环状RNA是实验取得成功的关键。
图1. 环状RNAs研究方法和功能剖析
广州吉赛生物致力于环状RNA相关产品的研发（多次登上顶刊和国际知名期刊），并提供相关技术服务。吉赛生物拥有自主研发的国内权威的RNase R试剂，基于纳米孔测序的circRNA全长鉴定和定量，专利技术的第六代高效率环状RNA过表达载体系统，国内领先的环状RNA人工制备专利和技术服务，以及配套的环状RNA科研技术服务。
二．环状RNAs作用机制
环状RNAs在基因表达的过程起着重要作用，从调节细胞核中的转录到细胞质中的翻译。针对已报道的高丰度环状RNAs，作者分别讨论了细胞中环状RNAs不同类型的作用机制。
1. 调控转录和剪切（图2A，B，C，D）
环状RNAs可以作为蛋白的海绵或支架，定位于细胞核的环状RNAs（主要是内含子环状RNAs）分子，通过与启动子部位结合，影响母基因及其他基因的转录调控。
2. 调控免疫（图2E）
结构分析发现，许多环状RNAs倾向于折叠成一到四个16-26 bp的分子内双体，而较少出现在线性转录产物中。这种双链体使环状RNAs具有结合和抑制细胞中的dsRNA活化蛋白激酶R（PKR）的作用，鉴于PKR在先天免疫反应中的核心作用，环状RNAs的异位表达在病毒感染时显示出抑制的细胞免疫反应。在病理生理条件下，自身免疫性疾病的患者体内环状RNAs表达水平降低。
3. 功能性复合物（图2F）
环状RNAs可以通过形成circRNP复合物，从而调节信号通路。
4. miRNA海绵（图2G）
含有多个miRNA结合位点的RNAs可以作为竞争性内源性RNAs（ceRNAs），从而调节miRNA在靶mRNAs上的作用。发挥miRNA海绵机制的环状RNAs大量涌现，但是相关环状RNAs和miRNA结合位点的数量是否足以在细胞中发挥可测量的作用有待进一步的探索。
5. 与mRNAs相互作用（图2H）
除了充当海绵状miRNAs的ceRNAs外，环状RNAs还可以直接结合mRNAs来影响基因表达输出。
6. 结合蛋白（图2I）
环状RNAs可以通过与蛋白质结合而胜过线性mRNAs，从而导致mRNA翻译的改变，充当竞争性结合的功能。同时，环状RNAs可以和蛋白结合，充当反应支架，调控后续的生物反应和功能。
图2. 细胞内环状RNAs的部分作用机制
7. 编码蛋白功能（图3）
除了环状RNAs在调节基因表达中的非编码作用，环状RNAs具有编码蛋白的新作用。以非帽依赖的方式，通过IRES序列或者m6A修饰诱导环状RNA序列的翻译。
图3. 可翻译的环状RNAs
三．环状RNAs生物医学应用
环状RNAs在构象、稳定性和免疫原性方面与线性RNA不同，这一事实促使人们尝试开发基于环状RNAs的技术。这些包括使用环状RNAs作为非编码适体来干扰细胞内过程，调节先天免疫反应，隔离疾病相关的miRNA和蛋白质，并作为反义RNA和延伸翻译的模板。此外，与疾病相关的环状RNAs正在成为治疗靶点，而环状RNAs可以作为生物标记物（图4）。
图4. 环状RNAs的生物医学应用
技术困境刺激前沿方法的发展，通常不同于线性RNAs研究中的方法，以解决环状RNAs的生物发生和功能。随着研究的深入，环状RNAs现在得到了更好的理解，至少有一部分相对丰富的环状RNAs在调节细胞核和细胞质中的遗传流动方面发挥着重要的细胞作用，它们的失调可能与生理学有关。然而，值得注意的是，许多低丰度环状RNA可能是剪接体的副产物，因此功能潜力很小。展望未来，解决它们在人类发展和疾病中的生理和病理作用，建立动物模型以更好地理解它们的作用，并改进开发环状RNAs疗法的新尝试，仍然至关重要。作者预测，将发现环状RNAs的其他作用，并将实施令人兴奋的基于环状RNAs的应用，以利于生物医学研究（即作为表达载体和海绵），以及作为RNA适体、基因表达平台、临床靶点和生物标记物的治疗模式。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.021