由于SARS-CoV-2病毒的不断进化以及针对现有疫苗的中和抗体反应持续时间的缩短，新的新冠疫苗的开发至关重要。奥密克戎等突变株位于受体结合区域（RBD）的棘突蛋白（Spike）突变，导致疫苗的有效性降低。合理设计的SARS-CoV-2 RBD和Spike蛋白可以作为潜在的免疫原，诱导有效的保护性免疫反应。
已知mRNA疫苗mRNA-1273和BNT162b2是使用编码野生型Spike的三聚体（S-2P）的线性转录物开发的，S-2P作为初代mRNA疫苗的初始免疫原，该三聚体对当前的变异毒株B.1.617.2和B.1.1.529的中和活性降低。
2022年3月28号，泰国玛希隆大学Patompon Wongtrakoongate在BioRxiv预印本发表文章Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by circular mRNA producing VFLIP-X spike in mice，报道了含有六种突变区域的Spike蛋白（K417N、L452R、T478K、E484K、N501Y和D614G），用产生的该嵌合突变型Spike抗原VFLIP-X的环状mRNA（circRNA）疫苗免疫小鼠，在增强对SARS-CoV-2高关注变异毒株（VOCs）和需留意变异株（VOIs）的抵抗后，诱导产生中和抗体长达7周。
作者首先使用Ⅰ型内含子自剪切的方法体外制备circRNA，使用萤火虫荧光素酶标记，并通过LNP（脂质纳米粒）递送肌肉注射BALB/c小鼠，活体成像清楚的检测到在24h和48h的小鼠的生物发光。
体外制备circRNA的LNP递送
作者主要对比了两种VFLIP Spike和HexaPro Spike抗原骨架。HexaPro为二代Spike抗原，包含6个脯氨酸突变，与初代相比拥有更高的稳定性和表达效率。VFLIP包含5个脯氨酸突变（与二代相比，恢复了986位置上天然Spike蛋白的赖氨酸，从而保留由K986介导的盐桥），一个灵活的裂解位点连接子（连接肽GGGSGGGS）和一个前聚体间的二硫键，表现出显著的稳定性和高产率，在没有外源三聚体基序的情况下保持三聚体状态[1]。
通过向VFLIP和HexaPro Spike引入5个来自Beta和Delt的RBD区域突变，分别构建VFLIP-X和HexaPro-X Spike抗原，用于比较两种不同的抗原设计引起的Spike蛋白的表达差异(图1A)。
作者绘制了一个包含各种突变株Spike序列和嵌合突变型（Wildtype-x）Spike序列的无根系统发育树，Wildtype-x拥有与Omicron-B.1.1.529更加接近的序列（图1C）。WB和免疫荧光检测发现，两种抗原均能表达RBD抗原，且表达水平相近。
图1. HexaPro-X和VFLIP-X结构示意图，Spike无根发育树
使用LNPs递送表达HexaPro-X或VFLIP-X的circRNA，用5 μg的circRNAs注射7周大的雌性BALB/c小鼠进行肌肉内免疫，3周后检测血清IgG滴度，VFLIP-X和HexaPro-X均诱导高浓度的血清抗体浓度，但只有接种VFLIP-X的小鼠血清才能诱导对Omicron-B.1.1.529假病毒的高度中和。
进一步检测发现，5 μg的VFLIP-X可以实现对野生型以及SARS-CoV-2变异体病毒的广谱中和，1 μg则未检测到明显的效果。既VFLIP-X可以诱导产生针对SARS-CoV-2变体的广谱中和抗体。
第一针注射三周后，第二针VFLIP-X疫苗可以触发靶向Omicron-B.1.1.529假病毒的中和抗体浓度持续增加（图2）。
图2. VFLIP-X刺激剂量依赖性的免疫应答
TH2偏向性免疫反应与疫苗相关的增强型呼吸道疾病有关，TH2偏向的免疫反应会导致严重的肺部疾病[2]。在接种完第二针VFLIP-X疫苗七周后，使用Omicron-B.1.1.529假病毒刺激分离的脾脏细胞，酶联免疫斑点检测分析细胞的免疫反应，接种VFLIP-X疫苗的小鼠可提高针对B.1.1.529的细胞免疫应答，且是TH1偏向型的。
图3. VFLIP-X可提高针对B.1.1.529的TH1偏向性细胞免疫应答。
本研究强调了表达高度稳定的VFLIP-X Spike免疫原的SARS-CoV-2 circRNA疫苗对广谱的SARS-CoV-2变异株具有中和活性，具有作为预防新型SARS-CoV-2变异株的新一代COVID-19病毒疫苗的潜力，并可实现TH1和TH2免疫反应的平衡。
原文链接:https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484759
参考文献：
[1].Eduardo Olmedillas,Structure-based design of a highly stable, covalently-linked SARS-CoV-2
spike trimer with improved structural properties and immunogenicity, bioRxiv preprint doi:https://doi.org/10.1101/2021.05.06.441046 , 2021.
[2].Ebenig, A. et al. In contrast to T<sub>H</sub>2-biased approaches, T<sub>H</sub>1 COVID-19 vaccines protect Syrian hamsters from severe disease in the absence of dexamethasone-treatable vaccine-associated enhanced respiratory pathology. bioRxiv, 2021.2012.2028.474359, doi:10.1101/2021.12.28.474359 (2021).
