2022年5月26日，丹麦奥胡斯大学分子生物学与遗传学系Jørgen Kjems教授在Nat Methods发表了一篇题为Best practice standards for circular RNA research的文章，文中根据作者的研究经验提出了一套circRNA研究指南，将专门讨论真核生物中由剪接体催化的反向剪接事件产生的主要circRNA。
大多的circRNA被认为是错误剪切的产物，随着高通量技术的发展，发现circRNA可以积累到超过mRNAs的水平并显示出组织特异性和发育特异性的特征。大多数真核生物circRNA是通过剪切体依赖的方式，反向剪切产生的，作者主要对剪切体依赖的circRNA的研究策略进行汇总和分析（图1a）。
CircRNA的作用机制主要分为细胞核内和核外两部分。细胞核circRNA通过募集蛋白质或者作为结构组分参与转录调控。细胞质circRNA被认为以多种方式发挥作用，包括作为miRNA和蛋白质的海绵，作为可能促进翻译后修饰（例如，磷酸化（P）、泛素化（Ub）和乙酰化（Ac））的蛋白支架，以及作为翻译模板（图1b）。
图1.环状RNA生物发生和功能概述
一．CircRNA验证和量化（图2）
PCR方法，最常用的是RT-PCR和RT-qPCR，使用不同的引物对生成跨越剪切位点的扩增子，对circRNA进行转录丰度分析。小circRNA的滚环扩增是导致circRNA检测假阳性的重要原因，基于杂交的方式可以减少假阳性的产生。反式剪切产生的重复序列同样会干扰反向剪切产物的检测，而RNase R处理可以排除线性转录物的干扰；
基于杂交的方法，1.基于杂交的northern检测，设计识别不同类型RNA的特异性探针，使用RNase R处理更加有助于circRNA相对应条带的识别；2.nanoString直接检测circRNA，使用捕获探针和报告探针联合识别BSJ来检测单个CircRNA；3.SplintQuant检测，是一种无需逆转录的方法，剪切位点的两部分由一组cDNA探针进行识别，进而在BSJ位点进行扩增；4.BaseScope检测，通过Z探针结合反向剪切位点两端，形成bDNA的链的对接位置，进而将信号放大到能够检测到的水平。
图2.环状RNA检测、验证和量化
二．CircRNA的干扰策略（图3）
1. SiRNA，针对BSJ设计的siRNA可以通过RNAi选择性切割circRNA，使线性化的RNA受到核酸外切酶的降解。RNAi需要注意的是，与siRNA的部分重叠可以驱动线性形式的miRNA样抑制，从而产生脱靶效应；在siRNA转染效率较低的系统中（例如神经元），建议使用病毒传递的短发夹RNA（shRNA）载体。与转染siRNAs的瞬时干扰相比，该策略还产生了更稳定的circRNA敲除。
2. Cas13，靶向BSJ的gRNAs可用于通过Cas13选择性降解circRNA形式，同时保持线性RNA完整。与siRNAs相比，gRNAs需要更广泛的序列与靶区重叠，因此不太容易发生靶区外效应；
3. Cas9，依赖Cas9的基因组编辑可以破坏circRNA的生物发生，通过使用gRNAs删除环状外显子侧翼的内含子或删除将两个剪接位点连接在一起的序列元件（例如，Alu元件和RBP位点）。在这两种情况下，在编辑的等位基因上都阻止了反向剪接。
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图3.环状RNA干扰方法
三．CircRNA的过表达策略
1. 体外合成，通过T4 RNA连接酶催化分子内直接成环，以及内含子核酶自剪切成环的方式可以实现circRNA的体外制备，环化产物的纯度和环化效率是影响体外制备circRNA应用的关键因素。
吉赛生物拥有国内领先的核心专利技术——一种制备环状RNA的方法（国家授权发明专利：202010094558.6），可以实现环状RNA规模化和高效制备，经过纯化回收后能够得到高浓度高纯度的环状RNA，可以直接用于细胞转染和动物注射等后续实验研究。
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2. 过表达质粒，过表达circRNA的一种常见方法是在质粒中的强启动子（CMV）和多聚腺苷酸化信号（PAS）之间插入感兴趣的外显子，外显子两侧是一组反向重复序列（IRs）。值得注意的是，从质粒中表达circRNA虽然更加接近体内环境，但是反向剪切的效率问题会导致线性转录本的存在，必要时需对线性和环转录本进行定量分析。
吉赛生物自2015年推出全国首个商业化circRNA过表达载体（国家授权发明专利：201510566302）以来，一直致力于circRNA过表达技术的改进和相关产品开发，持续优化现有的载体产品，目前已经开发第六代的circRNA过表达载体。
图4.环状RNA过表达方法
CircRNAs在生命的所有领域通过不同的机制形成。近年来，circRNA的论文数量呈爆炸式增长；然而，作为一个相对年轻的领域，circRNA生物学迫切需要通用的实验标准来分离、分析、表达和干扰circRNA。本文提到的研究策略将有助于推动该领域的发展，并更好地理解circRNA的功能。
原文链接：https://doi.org/10.1038/ s41592-022-01487-2
